粵藍(lán)鏈霉菌主要次級代謝產(chǎn)物分析及其生物合成基因簇的克隆與功能研究粵藍(lán)鏈霉菌(Streptomycesvietnamensis)GIMV4.0001是本研究室近年從熱帶原始森林土壤中分離獲得的一株鏈霉菌新種。前期研究發(fā)現(xiàn)該菌株能產(chǎn)生色調(diào)優(yōu)美的紫羅蘭藍(lán)色素。本研究對該菌的產(chǎn)色發(fā)酵條件進行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)高氏合成一號培養(yǎng)基是適合的產(chǎn)色培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基原料價格低廉,可作為工業(yè)化生產(chǎn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基;優(yōu)化的培養(yǎng)參數(shù)組合為:接種量5%,培養(yǎng)溫度30℃,180rpm振動培養(yǎng)7d。對該菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物進行了系統(tǒng)的研究,發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵產(chǎn)物對革蘭氏陽性細(xì)菌有較強的廣譜抗菌活性,對部分革蘭氏陰性菌也有不同程度的抑制作用,同時對HeLa腫瘤細(xì)胞也顯現(xiàn)出很強的抑制作用;薄層層析–生物顯影發(fā)現(xiàn)2個藍(lán)色組分B1、B2是主要的抗菌活性成分,通過質(zhì)譜、核磁共振等波譜分析,兩個藍(lán)色化合物分別被鑒定為榴菌素和榴菌素B。從發(fā)酵產(chǎn)物中還分離、鑒定了其它5個相關(guān)化合物,分別為醌茜蘭類色素Zg、Zgg、二氫Zg、MM44785和去鼠李糖基MM44785,其中二氫Zg和去鼠李糖基MM44785是兩個新的榴菌素相關(guān)化合物注1。對粵藍(lán)鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物生物合成途徑的多樣性進行了分析,發(fā)現(xiàn)該菌除榴菌素生物合成途徑外,還可能存在合成大環(huán)內(nèi)酯類、角環(huán)類化合物以及孢子色素等多條PKS途徑,為深入挖掘該菌可能存在的其它生物活性物質(zhì)提供了指導(dǎo)。采用分段、分步的策略,克隆測序了包含粵藍(lán)鏈霉菌榴菌素完整生物合成基因簇的序列37480bp;發(fā)現(xiàn)粵藍(lán)鏈霉菌榴菌素生物合成基因數(shù)目、基因排列等與紫紅鏈霉菌(S.violaceoruber)Tü22的榴菌素生物合成基因簇完全相同,但序列長度與要短1260bp,整個基因簇中存在大約100個小片段的插入或缺失,提示插入或缺失小片段可能是鏈霉菌基因組進化的基本機制之一?；浰{(lán)鏈霉菌與紫紅鏈霉菌的榴菌素生物合成基因簇總體上同源率較高,提示二者具有較近的共同祖先;然而基于16SrDNA序列的鏈霉菌屬系統(tǒng)進化發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn),粵藍(lán)鏈霉菌與紫紅鏈霉菌存在相對較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系,已知的榴菌素產(chǎn)生菌在鏈霉菌屬中也呈離散分布,因此,榴菌素生物合成基因簇在鏈霉菌屬內(nèi)可能發(fā)生了水平轉(zhuǎn)移,為抗生素生物合成基因簇存在水平轉(zhuǎn)移的觀點提供了有力的證據(jù);側(cè)翼基因orf35在粵藍(lán)鏈霉菌中的缺失和orf35基因3個碎片的發(fā)現(xiàn),呈現(xiàn)出了榴菌素生物合成基因簇在水平轉(zhuǎn)移之后進一步進化的一個情景,目前存在于粵藍(lán)鏈霉菌基因組中的榴菌素生物合成基因簇可被詮釋為基因水平轉(zhuǎn)移和垂直變異的共同結(jié)果。隨后分析了粵藍(lán)鏈霉菌對常用抗生素的天然抗性水平,發(fā)現(xiàn)粵藍(lán)鏈霉菌對阿普拉霉素、卡那霉素、鏈霉素、壯觀霉素、硫鏈絲菌素等均可用作粵藍(lán)鏈霉菌遺傳操的抗性標(biāo)記,并通過大腸桿菌–粵藍(lán)鏈霉菌屬間接合轉(zhuǎn)移的方法成功建立了粵藍(lán)鏈霉菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系。以衍自pCR2.1的重組質(zhì)粒替代基因組文庫cosmid作為突變模板質(zhì)粒,嘗試將PCRtargeting系統(tǒng)應(yīng)用于粵藍(lán)鏈霉菌,以阿普拉霉素抗性基因片段置換榴菌素生物合成的關(guān)鍵基因orf1、orf2、orf3,成功構(gòu)建了不產(chǎn)榴菌素的突變株,這是首次成功建立榴菌素產(chǎn)生菌的有效遺傳改造體系,為深入了解榴菌素生物合成及其調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。通過體外重組表達(dá)和體內(nèi)基因敲除等方法對榴菌素生物合成基因orf20進行了功能研究,發(fā)現(xiàn)攜帶表達(dá)orf20重組質(zhì)粒的大腸桿菌對百草枯的抗性顯著提高,而敲除orf20基因后的粵藍(lán)鏈霉菌突變株對百草枯的抗性水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化,但其色素產(chǎn)量(榴菌素)大幅提高,是野生株的3.3倍。這說明ORF20能夠替代大腸桿菌SoxR參與抗氧化脅迫的調(diào)控,但在原宿主粵藍(lán)鏈霉菌中并不參與抗氧化脅迫調(diào)控,而是對榴菌素的生物合成存在負(fù)調(diào)控效應(yīng)。對榴菌素外排基因orf15在粵藍(lán)鏈霉菌中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)規(guī)律進行了分析,發(fā)現(xiàn)在野生株開始產(chǎn)色前orf15轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平突然升高,產(chǎn)色后迅速降低;在敲除orf20基