深圳市人民醫(yī)院病理科分子實驗室姜陽陽2021-10-27腫瘤分子檢測方法與質(zhì)量控制醫(yī)學(xué)開展歷程的啟示經(jīng)驗醫(yī)學(xué)循證醫(yī)學(xué)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)診斷靠治療后期經(jīng)驗積累。診斷治療以人群、科學(xué)研究證據(jù)指導(dǎo)臨床實踐。診斷治療以個體為根底，更加提前、具體與精確。分子時代腺癌鱗癌21%25%36%7.8%3.3%2.6%2.2%0.8%0.7%0.7%0.1%肺腺癌：EGFR\KRAS\BRAF\ALK-ROS1\RET等檢測已是共識；肺鱗癌發(fā)生模式不同，檢測靶標(biāo)以擴增為主，同時EGFR、ALK\ROS1某些病例也有必要檢測。我們可以用的分子生物學(xué)手段：實時熒光PCR方法〔擴增阻礙突變系統(tǒng)法〔AmplificationRefractoryMutationSystem，ARMS〕、PCR-高分辨溶點曲線分析〔HRM〕、數(shù)字PCR等〕PCR-雜交法〔膜上、芯片[基因芯片]、乳膠顆粒[Luminex]〕PCR-Sanger測序PCR-焦磷酸測序新一代高通量測序PCR-SSCP、RFLP、dHPLC等熒光原位雜交〔FISH〕直接雜交免疫組化分子病理檢測的主要方法基因突變(SNPs)拷貝數(shù)改變(CopyNumberVariation,CNV)基因重排（Gene

rearrangement)蛋白(質(zhì))表達(dá)(Proteinexpression)免疫組織化學(xué)（IHC）…基因表達(dá)(mRNA/RNA

expression）反轉(zhuǎn)錄+熒光定量PCR（RT-qPCR)…FISH…DNAsequencing，

ARMS…檢測對象檢測基因檢測水平EGFR，KRAS，BRAF，BRCA,BCR-ABL，JAK2…EML4-ALK，ROS1，HER2，RET…BRCA1，TOP2A，TYMS…EGFR，EML4-ALK，HER2…國際肺癌協(xié)會專家共識

中國基因突變檢測專家共識

日本臨床專家共識IPASSINFORM大型臨床研究所采用DNA基因重排融合mRNA或5’/3’mRNA差異表達(dá)嵌合蛋白表達(dá)肺癌中ALK基因變異的表達(dá)調(diào)控FISH/CISHNGSRT-PCR5’/3’比較qRT-PCRRACE-PCR…IHC2個信號別離直徑的要求，使實際應(yīng)用中結(jié)果難以判斷有5-11%出現(xiàn)假陽性信號別離1，2，3工作強度大，費時主觀性強，受人為因素影響大橫向縱向操作簡單，時間短結(jié)果客觀，易于判讀，減少人為因素的影響除FFPE樣本外，還適用其他類型樣本組織1與EGFR、RET、ROS1等其他檢測不沖突，共用相同組織切片和PCR擴增程序，節(jié)約有限資源和時間中國熒光PCR儀器普及率更高，更加適合國情NTCPCFusionSample實時逆轉(zhuǎn)錄法〔RealTime-PCR〕CFDA批準(zhǔn)的基因檢測產(chǎn)品項目EGFRALKROS1ALK/ROS1IHC

√

FISH

√

RealTime-PCR√√√√基于RealTime-PCR方法檢測驅(qū)動基因的分子診斷產(chǎn)品獲得CFDA批準(zhǔn)最多2-3片F(xiàn)FPE樣品同時將DNA和RNA別離出來同時獲得EGFR、ALK和ROS1檢測結(jié)果節(jié)約樣本、節(jié)約時間、節(jié)約本錢DNA/RNAEGFR突變型ALK陽性或ROS1陽性EGFR野生型ALK陰性ROS1陰性吉非替尼厄洛替尼?？颂婺岚⒎ㄌ婺峥诉蛱婺嵘鹛婺崞渌委煼绞紻NA/RNA共別離劑盒EGFR/ALK+ROS12.5小時PCR4.5小時FFPE切片1-3片或活檢小標(biāo)本2021NSCLCNCCN指南對于NSCLC患者建議檢測EGFR和ALK基因狀態(tài)；對于ROS1/MET/RET/BRAF/HER2等嶄露頭角的靶基因也給予關(guān)注1.室內(nèi)質(zhì)量控制2.室間質(zhì)量評價分子病理實驗室的質(zhì)量控制1.建立標(biāo)準(zhǔn)化的實驗室2.具備資質(zhì)且相對固定的人員3.性能穩(wěn)定的試劑4.持續(xù)不斷的學(xué)習(xí)和開展質(zhì)控?醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗室管理方法?〔衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)[2021]194號〕?醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴展檢驗實驗室工作導(dǎo)那么?〔衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)[2021]194號〕試劑準(zhǔn)備區(qū)空氣流向標(biāo)本制備區(qū)空氣流向擴增區(qū)空氣流向產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間工作走向FISH實驗區(qū)臨床基因擴增實驗室標(biāo)準(zhǔn)化操作文件〔sop〕1.寫你所做2.做你所寫3.實驗室的精髓可操作性的sop文件人員資質(zhì)理想的試劑試劑方法的性能驗證及每批試劑的質(zhì)檢性能指標(biāo)：重復(fù)性〔精密度〕準(zhǔn)確性〔定量：回收率、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等；定性：方法學(xué)比較等〕線性范圍〔定量〕分析特異性測定下限抗干擾能力

資質(zhì)認(rèn)證試劑質(zhì)量試劑反響性能前后批號結(jié)果一致性測定下限批內(nèi)變異〔<10%)和批間變異〔<15-25%)你其實做了這些，但是你有記錄么？1.日常維護2.定期保養(yǎng)3.維修記錄實驗室最忠實的員工-----儀器全流程：標(biāo)本接收-石蠟切片-核酸提純-實時熒光定量PCR擴增-結(jié)果分析分析前：標(biāo)本接收、制片、填寫檢測申請單分析中：核酸提取、擴增、產(chǎn)物分析、檢測有效性判斷分析后：結(jié)果分析、報告審核、結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)：重復(fù)，可控，標(biāo)準(zhǔn)全流程室內(nèi)質(zhì)控組織蠟塊切片病理學(xué)評估核酸純化實驗/數(shù)據(jù)DNA模板質(zhì)量更重要，建議對提取的DNA模板進行質(zhì)量檢測：

OD260/OD280=1.8±0.2，

OD260/OD230≥1.7全流程室內(nèi)質(zhì)控檢查設(shè)定參數(shù)平臺期背景熒光閾值線設(shè)定閾值檢查對照組及內(nèi)外控曲線情況陽性質(zhì)控品突變樣本突變分析RNA制備逆轉(zhuǎn)錄選用CFDA認(rèn)證的檢測試劑認(rèn)證的核酸抽提試劑病理小樣本中性福爾馬林組織保護液快速低溫放置微量紫外分光光度計Q-PCREGFREML4-ALKK-rasB-rafPI3K好流程才有好結(jié)果F