關(guān)于細(xì)胞工程染色體工程染色體變異：在真核生物的體內(nèi)，染色體是遺傳物質(zhì)DNA的載體。當(dāng)染色體的數(shù)目發(fā)生改變時（缺少，增多）或者染色體的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時，遺傳信息就隨之改變，帶來的就是生物體的后代性狀的改變，這就是染色體變異。它是可遺傳變異的一種。根據(jù)產(chǎn)生變異的原因，它可以分為結(jié)構(gòu)變異和數(shù)量變異兩大類。一、染色體變異第2頁,共53頁，2024年2月25日，星期天第3頁,共53頁，2024年2月25日，星期天(一)染色體數(shù)目變異：染色體組（genome）：一個配子的全部染色體。細(xì)胞中的一組非同源染色體，它們在形態(tài)和功能上各不相同，但是攜帶著控制一種生物生長發(fā)育、遺傳和變異的全部信息，這樣的一組染色體，叫做一個染色體組整倍體(euploid)：體細(xì)胞內(nèi)含有完整的染色體組的類型非整倍體（aneuploid）：染色體組內(nèi)個別染色體數(shù)目有增減，使細(xì)胞內(nèi)的染色體數(shù)目不是基數(shù)的完整倍數(shù)。多倍體（polyploid）：每個體細(xì)胞含有3個或更多染色體組的個體，3，4，5，6，8倍體二倍體(diploid)：具有兩個染色體組的個體單倍體(haploid)：體細(xì)胞內(nèi)含有配子染色體數(shù)目的個體第4頁,共53頁，2024年2月25日，星期天二倍體多倍體單倍體非整倍體第5頁,共53頁，2024年2月25日，星期天（二）染色體結(jié)構(gòu)變異：易位translocation：染色體的某一片段移接到另一條非同源染色體上或同一條染色體上的不同區(qū)域

缺失deletion：染色體上某一區(qū)段及其帶有的基因一起丟失倒位inversion：染色體上某一區(qū)段連同帶有的基因順序發(fā)生180度倒轉(zhuǎn)重復(fù)replication：一個染色體上增加了相同的某個片斷第6頁,共53頁，2024年2月25日，星期天在自然條件和人為條件改變的情況下，染色體結(jié)構(gòu)的改變和染色體數(shù)目的增減，都將導(dǎo)致生物性狀的變異。染色體工程：按照人們的需要對生物的染色體進(jìn)行操作，添加、消減或替換染色體，從而達(dá)到定向選育新品種或創(chuàng)造人工新物種的目的。動物染色體工程主要包括染色體倍性改造、結(jié)構(gòu)改造及人工染色體的利用等技術(shù)。第7頁,共53頁，2024年2月25日，星期天二、動物染色體倍性改造

染色體倍性改造工程是指有目的、有計劃地增加或減少一組或幾組同源或異源染色體，以創(chuàng)造動植物新品種的一項染色體工程技術(shù)，主要包括多倍體育種和單倍體育種。第8頁,共53頁，2024年2月25日，星期天（一）動物的多倍體育種（1）染色體加倍技術(shù)（2）多倍體的倍性鑒定（3）動物多倍體育種的意義第9頁,共53頁，2024年2月25日，星期天

多倍體polyploid：每個體細(xì)胞含有三個或更多染色體組的個體，3，4，5，6，8倍體。在自然界高等植物中較常出現(xiàn)，而動物界較少。

當(dāng)所有的基本染色體組都來自同一物種的多倍體稱為同源多倍體(autopolyploid)

染色體組來自不同物種的多倍體稱為

異源多倍體(allopolyploid)。第10頁,共53頁，2024年2月25日，星期天（1）染色體加倍技術(shù)

1939年，F(xiàn)rankhauser和Griftiths首先在兩棲類中成功地誘發(fā)了三倍體。由于多倍體動物具有生長速度快，成活率高及抗病能力強等特點，所以人工誘導(dǎo)多倍體，改善動物經(jīng)濟性狀倍受重視?，F(xiàn)在，該技術(shù)已成為低等經(jīng)濟動物育種的主要技術(shù)之一，其成果已經(jīng)應(yīng)用于生產(chǎn)實踐，取得了明顯的經(jīng)濟效益和社會效益。第11頁,共53頁，2024年2月25日，星期天

多倍體是由細(xì)胞內(nèi)染色體加倍而形成的，即通過抑制受精卵第二極體的放出，產(chǎn)生三倍體或抑制第一次卵裂產(chǎn)生四倍體，可以利用生物、化學(xué)和物理的方法得到多倍體:1)化學(xué)誘導(dǎo)方法：化學(xué)物質(zhì)如細(xì)胞松弛素B等常用的動物多倍體誘導(dǎo)劑。

2)物理學(xué)方法：包括溫度休克法、水靜壓法和高鹽高堿法等。

3)生物學(xué)方法：雜交尤其是種間雜交獲得異源多倍體。第12頁,共53頁，2024年2月25日，星期天1)化學(xué)誘導(dǎo)方法：

有些化學(xué)物質(zhì)也可以用來阻止第二極體的排出或受精卵的有絲分裂而產(chǎn)生三倍體或四倍體。

?細(xì)胞松弛素Bcytochalasin

抑制肌動蛋白聚合成微絲，從而抑制細(xì)胞質(zhì)分裂。是最常用的動物多倍體誘導(dǎo)劑。

?秋水仙堿colchicine抑制細(xì)胞分裂中紡錘絲的形成，因而抑制有絲分裂，這在植物中已經(jīng)廣泛應(yīng)用。

其它藥物麻醉劑如N2O和聚乙二醇等。

缺點：化學(xué)藥品一般比較昂貴、且具有毒性，影響處理后的胚胎發(fā)育，同時加上化學(xué)藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的多倍體往往是在育種上沒有價值的鑲嵌體，所以化學(xué)方法在實際中的應(yīng)用不及物理方法。第13頁,共53頁，2024年2月25日，星期天2)物理學(xué)方法?溫度休克法：冷休克法（0～5度）和熱休克法（30度左右）。

定義：用略高于或略低于致死溫度的冷或熱休克來誘導(dǎo)三倍體或四倍體的方法。

關(guān)鍵：能否成功阻止第二次成熟分裂或第二極體的排出。要達(dá)到這一點，必須考慮溫度處理的開始時間（TA）、處理持續(xù)時間（D）和處理溫度（T）三個因素。以及能否抑制受精卵的卵裂。

目前對魚類使用溫度休克法誘導(dǎo)三倍體的工作報道較多。一般來說，冷水性魚類如鮭科種類應(yīng)用熱休克法、而溫水性魚類用冷休克效果較好。

優(yōu)點：廉價、易操作，是誘導(dǎo)動物細(xì)胞多倍體化的常用手段，也有利于大規(guī)模生產(chǎn)使用。第14頁,共53頁，2024年2月25日，星期天?水靜壓法：采用較高的水靜壓（65kg/cm2）來抑制第二極體的放出或第一次卵裂產(chǎn)生多倍體。

這種方法誘導(dǎo)率高（一般在90％～100％）、處理時間（3～5min）短，對受精卵損傷小、成活率高。

但是，該法需要專門的設(shè)備——水壓機，成本較高，其樣品室容量有限，處理卵的量有限，所以不適于大規(guī)模生產(chǎn)的。

第15頁,共53頁，2024年2月25日，星期天3）生物學(xué)方法生物學(xué)上主要通過雜交尤其是種間雜交獲得異源多倍體。

例如用雌性草魚（2n＝48）與雄性三角魴（2n＝48）雜交可以獲得子一代草魴雜種三倍體。

這種不同科、屬、種之間的遠(yuǎn)源雜交、會導(dǎo)致第二極體不排出，而產(chǎn)生多倍體。第16頁,共53頁，2024年2月25日，星期天（2）多倍體的倍性鑒定

染色體計數(shù)（直接法）——是鑒定多倍性的一個準(zhǔn)確的直接方法。質(zhì)量好的染色體標(biāo)本可以從胚胎獲得，因為胚胎的分裂指數(shù)高。

DNA含量測定（直接法）——流式細(xì)胞儀（flowcytomety）是測定DNA含量比較準(zhǔn)確的方法。第17頁,共53頁，2024年2月25日，星期天

體積測量——一般，細(xì)胞核大小與染色體數(shù)目成比例增加，而且為維持恒定的核質(zhì)比例，隨著細(xì)胞核的、增大，細(xì)胞大小也按比例增加。因此組成多倍體有機體的細(xì)胞及細(xì)胞核通常要比二倍體大一些。但多倍體的器官或身體并不一定都比二倍體大。（間接法）例如，魚多倍體常通過測量紅細(xì)胞來鑒定其多倍性。為了更準(zhǔn)確地反映倍性常和直接法結(jié)合使用。另外，用蛋白質(zhì)電泳、通過對血液化學(xué)組成成分以及酶的含量的生化分析也可用于多倍體的鑒定。（間接法）第18頁,共53頁，2024年2月25日，星期天（3）動物多倍體育種的意義?許多誘導(dǎo)的多倍體動物如兩棲類、魚類、貝類等具有良好的生存力和生長率。

低等動物種間雜交優(yōu)勢明顯（生長快、具有兩個不同種的優(yōu)良特性），但成活率較低。三倍體可增加種間雜種的存活率。

?利用三倍體不育的特性，將生殖腺發(fā)育消耗的能量用于動物生長……?多倍體育種技術(shù)方法簡單，具有潛在的理論和應(yīng)用價值。四倍體與二倍體雜交獲得的三倍體與二倍體存率活率相當(dāng)。是產(chǎn)生三倍體的好辦法。難點：準(zhǔn)確的處理時間、誘導(dǎo)率、成活率、孵化率、倍性鑒定方法等還未解決第19頁,共53頁，2024年2月25日，星期天（二）動物的單倍體育種單倍體育種：就是指利用人工的方法進(jìn)行單性生殖。不僅能夠為研究發(fā)育機制提供特殊的途徑，而且在養(yǎng)殖動物的繁育上還有能夠創(chuàng)造具有特殊經(jīng)濟價值的單性群體（如母雞、奶牛及雄蠶）。第20頁,共53頁，2024年2月25日，星期天

（1）人工單性生殖人工單性生殖方法主要包括

1）雌核發(fā)育（gynogenesis）

2）雄核發(fā)育（androgenesis）

第21頁,共53頁，2024年2月25日，星期天1）雌核發(fā)育（gynogenesis），俗稱假受精，意指精子雖然正常地鉆入和激活卵子，但精子的細(xì)胞核并未參與卵球的發(fā)育，精子的染色體很快消失，胚胎的發(fā)育僅在母體遺傳的控制下進(jìn)行。

自然界中動物天然存在的雌核發(fā)育頻率極低。在一些無脊椎動物和魚類等存在。第22頁,共53頁，2024年2月25日，星期天1911年，赫特威氏Hertwig就第一個成功地人工消除了精子染色體活性，并發(fā)現(xiàn)了“赫特威氏效應(yīng)”。輻射劑量在極限以下，精子和受精胚胎均正常，輻射劑量漸增，胚胎存活率下降，繼續(xù)增加輻射劑量，回復(fù)到正常卵裂，胚胎存活率提高。第23頁,共53頁，2024年2月25日，星期天第24頁,共53頁，2024年2月25日，星期天2）雄核發(fā)育（androgenesis）是指因經(jīng)過紫外線、X

射線或γ射線處理的卵子與正常的精子受精，再在、適當(dāng)時間施以冷、熱或高壓等物理處理，使進(jìn)入卵子內(nèi)的精子染色體加倍，而發(fā)育成為完全為父本性狀的二倍體。雄核發(fā)育的個體的生存率非常低，這是由于精子基因型的純合性、卵子由于照射的損傷和阻止第一次卵裂處理的損傷等原因造成的。但是仍舊在遺傳學(xué)基礎(chǔ)理論和育種中都有一定的價值，對YY雄性引起的性別控制等也有特殊的意義。

第25頁,共53頁，2024年2月25日，星期天（2）人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的方法人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育是指用經(jīng)過紫外線、X射線或γ射線等處理后的失活精子來“受精”，再在適當(dāng)時間施以冷、熱、高壓等物理處理，以抑制第二極體的排出，使卵子發(fā)為正常的二倍體動物。

凡雌核發(fā)育的個體，都具有純母系的單倍體染色體組，依賴于卵子染色體組的二倍體化。第26頁,共53頁，2024年2月25日，星期天雌核發(fā)育的關(guān)鍵問題

要達(dá)到實驗性二倍體雌核發(fā)育目的，必須解決兩個最主要的問題：

1)人為地使精子的遺傳物質(zhì)失活

2)雌核的二倍體化

第27頁,共53頁，2024年2月25日，星期天1）精子遺傳物質(zhì)的失活不同種類的物理輻射和化學(xué)藥品的處理都可以導(dǎo)致精子遺傳物質(zhì)的失活。

物理輻射包括γ射線（通常用60Coγ）、X射線和紫外線。

γ射線（通常用60Coγ）和X射線具有較高的穿透力，能誘使染色體斷裂。

紫外光能誘使胸腺嘧啶二聚化，這一過程能在光作用下修補復(fù)活。

化學(xué)方法：采用化學(xué)物質(zhì)如

甲苯胺藍(lán)、乙烯尿素和二甲基硫酸等化學(xué)物質(zhì)消除精子染色體遺傳活性。此外，還可采用顯微手術(shù)直接除去受精卵雄性原核。第28頁,共53頁，2024年2月25日，星期天2）雌核的二倍體化

利用保留卵球第二極體或者阻礙受精卵早期有絲分裂，都可以實現(xiàn)二倍體化。如前節(jié)所述，利用溫度、壓力或化學(xué)方法可以誘使卵球二倍體化，如冷休克、熱休克、流體靜水壓、細(xì)胞松弛素B等。

第29頁,共53頁，2024年2月25日，星期天（3）雌核發(fā)育的鑒別經(jīng)人工或自然誘導(dǎo)的雌核發(fā)育個體，需經(jīng)一定的鑒定，以證明它確屬雌核發(fā)育的個體，精子在胚胎發(fā)育中確實沒有在遺傳方面做出貢獻(xiàn)。

鑒別雌核發(fā)育的個體，通常以顏色、形態(tài)以及生化等方面的指標(biāo)為依據(jù)。例如，鯉魚中，用輻射處理正常全鱗片鯉魚的精液，授予具散鱗片類型的鯉魚卵，獲得100%散鱗片子代，表明為100%的雌核發(fā)育個體。

通過細(xì)胞學(xué)的研究能更精確的判別雌核發(fā)育。若是雌核發(fā)育，其囊胚細(xì)胞中只出現(xiàn)一套來自雌核的染色體，否則雌核和雄核染色體各占一半，得到的是雜交種。

第30頁,共53頁，2024年2月25日，星期天第31頁,共53頁，2024年2月25日，星期天（一）動物染色體結(jié)構(gòu)的改造的方法

1.放射線誘導(dǎo)放射線誘導(dǎo)可以使染色體產(chǎn)生缺失、易位、倒位、復(fù)制及基因內(nèi)的點突變。

例如，

利用ES細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生突變，再將帶有突變的

ES細(xì)胞植入小鼠的囊胚，從而產(chǎn)生帶有突變的個體，進(jìn)一步進(jìn)行功能的研究。

Thomas等用此方法在小鼠的9號染色體的

Ncam位點，產(chǎn)生了一系列的缺失突變，缺失的大小都在3cM以下，有的可達(dá)35cM,缺失圖譜幾乎包括了9號染色體的一半，為研究9號染色體的功能提供了很好的材料。放射線誘導(dǎo)產(chǎn)生的突變不能定位，隨機發(fā)生。三、動物染色體結(jié)構(gòu)的改造第32頁,共53頁，2024年2月25日，星期天2.Cre/loxP介導(dǎo)染色體重組

Cre/loxP是一種常用的重組系統(tǒng)。Cre重組酶是在噬菌體P1中發(fā)現(xiàn)的一個38kDa的蛋白質(zhì)，其名稱來源于causerecombination，它能識別34bp的特異序列（loxP

）,介導(dǎo)兩個loxP之間的序列發(fā)生重組，此過程不需要任何其他輔助因子的幫助，loxp的位置和方向不同，Cre重組酶介導(dǎo)形成的產(chǎn)物亦不同，可以導(dǎo)致染色體的刪除/整合、倒位、易位，實現(xiàn)染色體的定點操作。第33頁,共53頁，2024年2月25日，星期天loxP

（locusofcrossingover(x)inp1）的序列特征：

LoxP位點是一段含有34個堿基對的序列，其兩端為13bp的反相重復(fù)序列，之間有一個8bp的不對稱核心序列，決定LoxP的方向。第34頁,共53頁，2024年2月25日，星期天

一個線形DNA分子或染色體上有兩個同向的loxP位點時，經(jīng)Cre酶作用，位點之間的片段被環(huán)化，游離于線形DNA分子或染色體之外，此時線形分子或染色體和環(huán)狀分子上各留一個loxP位點。

——刪除

上述過程的逆向過程就是一種整合的過程。——整合

第35頁,共53頁，2024年2月25日，星期天

一個線形DNA分子或染色體上有兩個反向的loxP位點時，Cre酶作用后發(fā)生位點之間片段的倒位——倒位第36頁,共53頁，2024年2月25日，星期天

兩個線形DNA分子或染色體上各有一個或兩個同向的loxP位點時，Cre酶可導(dǎo)致分子間片段的轉(zhuǎn)位?！孜坏?7頁,共53頁，2024年2月25日，星期天（二）染色體易位工程實例雄蠶繭比雌蠶繭出絲率高20%以上，體質(zhì)比雌蠶要強壯，養(yǎng)蠶生產(chǎn)上所用一代雜交種如果全是雄蠶，那么既不增加成本，又不需要多費勞力就可增加10%-15%的蠶絲。近年來，運用輻射誘變和染色體工程手段先后培育出有性別標(biāo)記的限性蠶品種。目前生產(chǎn)上可利用的有卵色限性系、斑紋限性系和繭色限性系。第38頁,共53頁，2024年2月25日，星期天卵色限性系：

家蠶有28對染色體，性染色體組型為ZW型，雌蠶（ZW），雄蠶（ZZ）。

用輻射誘發(fā)兩個第10染色體向w染色體易位的品系。

其中一個在易位的第10號染色體片段上含有白卵基因ω3

另一個含有白卵基因ω2

+ω2和+ω3

有互補作用，只有同時存在是才表現(xiàn)黑卵

ω2和

ω3

均為隱性基因，只要其中一個成為純合體時便表現(xiàn)為白卵。

這種易位雌蠶同持有ω2/ω2和

ω3/ω3

的雄蠶交配，分別得到黑雌卵和白雄卵。第39頁,共53頁，2024年2月25日，星期天

采用這樣的品系繁殖時，可由光電選卵機多選雄卵孵化，提高產(chǎn)率，降低成本。第40頁,共53頁，2024年2月25日，星期天四、人工染色體

人工染色體(artificialchromosome)指人工構(gòu)建的含有天然染色體基本功能單位的載體系統(tǒng)。人工染色體研究的興起是染色體工程的一個里程碑。在對真核生物進(jìn)行基因克隆、基因轉(zhuǎn)移，以及建立真核生物染色體圖的過程中，都要求基因載體的大容量和在真核細(xì)胞中的比較穩(wěn)定地持續(xù)地傳代，以保證所克隆基因的完整以及對宿主染色體的整合（integration）。目前正在研究或應(yīng)用的有：yeastartificialchromosome(YAC)、(Bacterialartificialchromosome，BAC)以及mammalianartificialchromosome。第41頁,共53頁，2024年2月25日，星期天（一）酵母人工染色體yeastartificialchromosome(YAC)1982年Szostake與Blackburn指出染色體要確保在細(xì)胞分裂中保持穩(wěn)定，必須能夠自我復(fù)制和向子細(xì)胞平均分配，它需要3個關(guān)鍵序列：自主復(fù)制DNA序列(autonomousreplicationsequences,ARS)，DNA復(fù)制的起點；端粒DNA序列（telomereDNAsequences，TEL），結(jié)束復(fù)制，確保染色體的獨立性和穩(wěn)定性；著絲粒DNA序列（centromereDNAsequences)確保染色體在細(xì)胞分裂時能平均分配到子細(xì)胞中。1983年Murray等人首次成功構(gòu)建了包括著絲粒、端粒、復(fù)制子和外源DNA總長度為55Kb的酵母人工染色體。第42頁,共53頁，2024年2月25日，星期天

1981年，Burke等人構(gòu)建了能克隆大片段人體DNA分子的載體YAC，證明YAC可用來構(gòu)建高等生物完整基因組文庫，插入片段比通常所用載體的容納能力大10倍以上，克隆容量達(dá)105-1010bp。這樣YAC就彌補了以前常用克隆載體的容納極限與高等生物物理圖譜構(gòu)建之間的缺口，在人類基因組計劃研究中發(fā)揮了重要作用。第43頁,共53頁，2024年2月25日，星期天YAC克隆技術(shù):1.基因組DNA酶切大片段的獲取提取待研究的染色體DNA,用適合的DNA內(nèi)切酶將DNA酶切為期望大小的片段，進(jìn)行脈沖電泳分離，將所需的酶切DNA片段的電泳條帶用無菌手術(shù)刀切割回收。2.YAC載體臂的制備

按常規(guī)的堿變性法抽提YAC質(zhì)粒。然后進(jìn)行BamHI和EcoRI酶解（先用BamHI

酶解再用EcoRI酶解），獲取YAC載體左右臂。堿性脫磷酯酶脫磷處理。第44頁,共53頁，2024年2月25日，星期天3.YAC臂與目的DNA大片段的鏈接

YAC載體左右兩臂都帶有選擇標(biāo)記，用于轉(zhuǎn)化酵母后的篩選，常用的標(biāo)記如顯性選擇標(biāo)記G418和CYH。用T4連接酶將分離的大片段DNA與YAC載體鏈接，構(gòu)建YAC重組體。第45頁,共53頁，2024年2月25日，星期天4.YAC重組體對酵母的轉(zhuǎn)化5.鑒定YAC基因庫的質(zhì)量

6.目的基因YAC克隆的篩選7.目的基因YAC克隆的鑒定第46頁,共53頁，2024年2月25日，星期天YAC是目前容量最大的載體，可插入100萬堿基以上的DNA片段，既可以保證基因結(jié)構(gòu)的完整性，又可以大大減少核基因庫所需的克隆數(shù)目，從而使文庫的操作難度減少。YAC既可以連很長的連續(xù)排列的DNA，又可以小到能夠方便地通過亞克隆進(jìn)行DNA序列分析研究，這種特性對于目前正在實施的各種基因組計劃意義極大。缺點：插入片段大，穩(wěn)定性差；插入片段易缺失，使文庫不完整；插入片段易重排，造成序列錯誤；文庫中嵌合現(xiàn)象嚴(yán)重，影響基因的分離和分析；YAC與酵母的染色體結(jié)構(gòu)極為相似，從酵母細(xì)胞中難以分離。第47頁,共53頁，2024年2月25日，星期天（二）細(xì)菌人工染色體

BAC載體是基于大腸桿菌的F質(zhì)粒構(gòu)建的高容量低拷