實(shí)驗(yàn)三

油鏡使用和細(xì)菌形態(tài)觀察

1、顯微鏡油鏡的使用

2、細(xì)菌形態(tài)的觀察（示教）

3、革蘭氏染色

4、芽胞染色

實(shí)驗(yàn)三油鏡使用和細(xì)菌形態(tài)觀察1、顯微鏡油鏡的使用2、一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

?學(xué)習(xí)并掌握普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造和油鏡的使用技術(shù)及維護(hù)的基本知識(shí)

（一）顯微鏡油鏡的使用

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)并掌握普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造和油鏡的使用技二、顯微鏡及油鏡使用原理

?顯微鏡的構(gòu)造

1.光學(xué)部分目鏡

、

物鏡

、

照明裝置(聚光鏡、

虹彩光圈、

反光鏡等)。它使檢視物放大,生成物象。

二、顯微鏡及油鏡使用原理?顯微鏡的構(gòu)造2.機(jī)械部分:鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺(tái)、載物臺(tái)轉(zhuǎn)移器、粗調(diào)節(jié)器、細(xì)調(diào)節(jié)器等部件.它起著支持、調(diào)節(jié)、

固定等作用.2.機(jī)械部分:鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺(tái)、載物臺(tái)轉(zhuǎn)圖1-1-2光學(xué)顯微鏡的成像原理

倒立的虛像

圖1-1-2光學(xué)顯微鏡的成像原理倒立的虛像?顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率

1.放大倍數(shù)：物鏡放大倍數(shù)×目鏡放大倍數(shù)

2.

顯微鏡的分辨率:是表示顯微鏡辨析兩點(diǎn)之間距離的能力?？捎霉奖硎緸椋?/p>

D=λ/2n·sin(α/2)

式中D：物鏡分辨出物體兩點(diǎn)間的最短距離。

?：可見(jiàn)光的波長(zhǎng)（平均0.55?m)n:

物鏡和被檢標(biāo)本間介質(zhì)的折射率。

?：鏡口角（即入射角）。

D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰

?顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率?油鏡使用的原理

油鏡，即油浸接物鏡。當(dāng)光線由反光鏡通過(guò)玻片與鏡頭之間的空氣時(shí)，由于空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發(fā)生散射，降低了視野的照明度。若中間的介質(zhì)是一層油（其折射率與玻片的相近），則幾乎不發(fā)生折射，增加了視野的進(jìn)光量，從而使物象更加清晰。

?根據(jù)公式D=λ/2n·sin(α/2)，增大分母，使得D值減小，分辨率增大。

?油鏡使用的原理油鏡，即油浸1.不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。

2.鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度

3.觀察標(biāo)本時(shí)，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當(dāng)目視接目鏡時(shí)，特別在使用油鏡時(shí)，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。

4.拿顯微鏡時(shí)，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。

5.油鏡使用結(jié)束后，物鏡用擦鏡紙擦三遍：第一遍擦去多余的香柏油；第二遍擦鏡紙蘸上二甲苯再擦鏡頭；第三遍再用干凈的擦鏡紙擦去多余的二甲苯。

6.顯微鏡應(yīng)存放在陰涼用擦鏡紙擦干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。

顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項(xiàng)

1.不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。2.鏡面只能用三.顯微鏡油鏡觀察操作方法

在高倍鏡或低倍鏡下找到要觀察的樣品區(qū)域后，然后將油鏡轉(zhuǎn)到工作位置。在待觀察的樣品區(qū)域滴加香柏油，從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器使油鏡浸在鏡油中并幾乎與標(biāo)本相接。然后用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)，在目鏡下找到最合適的觀察點(diǎn)。

三.顯微鏡油鏡觀察操作方法在高倍鏡或低倍鏡下找到要?油鏡使用畢后：上升鏡筒，取下載玻片，用擦鏡紙拭去鏡頭上的鏡油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留的油跡，最后用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。

?油鏡使用畢后：上升鏡筒，取下載玻片，用擦鏡紙拭去鏡頭上的鏡?本實(shí)驗(yàn)室按學(xué)號(hào)使用固定編號(hào)的顯微鏡，顯微鏡的保養(yǎng)由對(duì)應(yīng)學(xué)號(hào)的同學(xué)負(fù)責(zé)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中如果所用顯微鏡不能使用，自行與其他同學(xué)調(diào)節(jié)。但顯微鏡如果出現(xiàn)問(wèn)題，由對(duì)應(yīng)學(xué)號(hào)的同學(xué)承擔(dān)責(zé)任。

?本實(shí)驗(yàn)室按學(xué)號(hào)使用固定編號(hào)的顯微鏡，顯微鏡的保養(yǎng)由對(duì)應(yīng)學(xué)號(hào)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

進(jìn)一步熟悉使用油鏡觀察微生物的方法，初步認(rèn)識(shí)細(xì)菌的基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)特征

（二）細(xì)菌形態(tài)的觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)一步熟悉使用油鏡觀察微生物的方法，初步二、觀察內(nèi)容

基本形態(tài)：桿菌，球菌（注意大小、染色性、排列）

特殊結(jié)構(gòu)：鞭毛，芽胞，莢膜（先找到菌體，再仔細(xì)觀察特殊結(jié)構(gòu)）

以畫(huà)圖的方式完成該實(shí)驗(yàn)的報(bào)告

二、觀察內(nèi)容基本形態(tài)：桿菌，球菌（注意大小、染色性、排列）桿菌（大腸桿菌，G-）

畫(huà)圖注意事項(xiàng)：1、以圓圈表示視野

2、注意菌體大小比例合適

3、標(biāo)出菌體顏色，顯示典型排列方式

4、特殊結(jié)構(gòu)標(biāo)出菌體和特殊結(jié)構(gòu)所在位置

桿菌（大腸桿菌，G-）畫(huà)圖注意事項(xiàng)：1、以圓圈表示視野（三）革蘭氏染色

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

學(xué)習(xí)微生物涂片、革蘭氏染色的基本技術(shù)

（三）革蘭氏染色一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)微生物涂片、革蘭氏染色二、

革蘭氏染色的工作原理

?革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中重要的鑒別染色法。有芽孢的桿菌和絕大多數(shù)球菌以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏陽(yáng)性反應(yīng)；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無(wú)芽孢桿菌都呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。

二、革蘭氏染色的工作原理?革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中重要的?根據(jù)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌之間細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)差異來(lái)達(dá)到染色的目的的。

?先用結(jié)晶紫初染，所有的細(xì)菌都被染成初染料的藍(lán)紫色；

?然后用碘媒染，它與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫—碘復(fù)合物，從而增強(qiáng)了染料與細(xì)菌的結(jié)合力。

?然后再用乙醇脫色處理

?根據(jù)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌之間細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)差異來(lái)達(dá)到染實(shí)驗(yàn)三顯微鏡油鏡的使用及細(xì)菌形態(tài)觀察

?由于革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、壁厚、類(lèi)脂質(zhì)含量低，脫色時(shí)網(wǎng)孔收縮，結(jié)晶紫—碘不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)，復(fù)染時(shí)仍保持藍(lán)紫色。

?而革蘭氏陰性菌由于細(xì)胞壁的肽聚糖層較薄、類(lèi)脂含量高，所以當(dāng)脫色處理時(shí)類(lèi)脂被乙醇溶解，細(xì)胞壁透性增大，結(jié)晶紫—碘復(fù)合物被洗脫，復(fù)染時(shí)細(xì)胞被染上復(fù)染劑的顏色（紅色）。

?由于革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、壁厚、類(lèi)大腸桿菌

葡萄球菌

大腸桿菌葡萄球菌三、革蘭氏染色的操作方法

無(wú)菌操作

涂片

干燥

固定

染色

水洗

干燥

鏡檢

三、革蘭氏染色的操作方法無(wú)菌操作涂片干燥固定

（1）涂片：先在載玻片上滴一滴生理鹽水，再在菌平板上取一小環(huán)培養(yǎng)24小時(shí)的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌體于生理鹽水中涂片（，分別于斜面上挑取少許菌苔于水滴中，混勻并涂成薄膜），把菌液充分涂開(kāi)，使其分布均勻。

注意：載玻片要潔凈無(wú)油跡；滴生理鹽水和取菌不宜過(guò)多，涂片要均勻，不可過(guò)于濃厚

（1）涂片：先在載玻片上滴一滴生理鹽水，再在菌平板上取一小載玻片

水滴

菌體

涂片

載玻片水滴菌體涂片染色前必須固定細(xì)菌，其目的是：

一是殺死細(xì)菌并使菌體粘附于玻片上。

二是增加其對(duì)染料的親和力。常用的有加熱和化學(xué)固定兩種方法。固定時(shí)盡量維持細(xì)胞原有的形態(tài)。

染色前必須固定細(xì)菌，其目的是：一是殺死細(xì)菌并使菌體粘附于玻⑵

干燥：把上面涂好的片于室溫下自然干燥。

⑶

涂面朝上，在火焰上方過(guò)幾次以熱固定菌體（此操作的目的是使得細(xì)胞質(zhì)凝固，以固定細(xì)胞形態(tài)，并使之牢固附著在載玻片上）。固定時(shí)通過(guò)火焰1—2次即可。

注意：不可過(guò)熱，以載玻片不燙手為宜，溫度過(guò)高會(huì)改變甚至破壞細(xì)胞形態(tài)。

⑷

初染：滴數(shù)滴結(jié)晶紫于菌膜上（以剛好完全覆蓋菌膜為宜）初染1--2分鐘min，水洗。

⑸

媒染：滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約1min，水洗。

⑵干燥：把上面涂好的片于室溫下自然干燥。⑶涂面朝上，⑹

脫色：用濾紙吸去載玻片上面的殘水，將玻片傾斜，用95％酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時(shí)為止，約20—30s，立即用水沖凈酒精。

注意：革蘭氏染色結(jié)果是否正確，乙醇脫色是整個(gè)操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，脫色不足，陰性菌被誤染成陽(yáng)性菌，脫色過(guò)度，陽(yáng)性菌被誤染成陰性菌。

⑹脫色：用濾紙吸去載玻片上面的殘水，將玻片傾斜，用95％酒⑺復(fù)染：用番紅液染1—2min,水洗。

⑻鏡檢：干燥后（室溫下晾干），置油鏡觀察（先在低倍鏡，然后在油鏡下觀察菌體細(xì)胞的形態(tài)）。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色。

注意：以分散開(kāi)的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過(guò)于密集的細(xì)菌，常常呈假陽(yáng)性。

（9）同法在一載玻片上以大腸桿菌與金黃色葡萄球菌混合制片，作革蘭氏染色對(duì)比。

⑺復(fù)染：用番紅液染1—2min,水洗。⑻鏡檢：干燥后（室溫(10).實(shí)驗(yàn)結(jié)果的記錄：

要求在用顯微鏡觀察（左眼觀察）的同時(shí)在實(shí)驗(yàn)記錄本上畫(huà)下你所觀察到的細(xì)菌的形態(tài)。

(10).實(shí)驗(yàn)結(jié)果的記錄：要求在用顯微鏡觀察（左眼觀察）?本實(shí)驗(yàn)每人做一張。

?實(shí)驗(yàn)報(bào)告中要畫(huà)圖表示結(jié)果。

?本實(shí)驗(yàn)每人做一張。?實(shí)驗(yàn)報(bào)告中要畫(huà)圖表示結(jié)果。思考題

1.涂片為何要固定？固定加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)怎樣

2.分析影響革蘭氏染色結(jié)果的因素。

思考題1.涂片為何要固定？固定加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)怎樣2.分析一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

熟悉芽胞染色的方法

（四）芽胞染色

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖煜ぱ堪旧姆椒ǎㄋ模┭堪旧?、芽胞染色的原?/p>

細(xì)菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易著色，若用一般染色法只能使菌體著色而芽胞不著色(芽胞呈無(wú)色透明狀)。芽胞染色法就是根據(jù)芽胞既難以染色而一旦染上色后又難以脫色這一特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。所有的芽胞染色法都基于同一個(gè)原則：除了用著色力強(qiáng)的染料外，還需要加熱，以促進(jìn)芽胞著色。當(dāng)染芽胞時(shí)，菌體也會(huì)著色，然后水洗，芽胞染上的顏色難以滲出，而菌體會(huì)脫色。然后用對(duì)比度強(qiáng)的染料對(duì)菌體復(fù)染，使菌體和芽胞呈現(xiàn)出不同的顏色，因而能更明顯地襯托出芽胞，便于觀察。

二、芽胞染色的原理細(xì)菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低三、芽孢染色法步驟

(1)取37℃培養(yǎng)24h～36h的枯草芽孢桿菌作涂片，并干燥，固定。

(2)于載片上滴入3～5滴5％孔雀綠水溶液。

(3)用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時(shí)，開(kāi)始計(jì)算時(shí)間約4～5min。加熱過(guò)程中切勿使染料蒸干，必要時(shí)可添加少許染料。

(4)傾去染液，