關于蛋白質結合相互作用及研究方法*DNA

*RNA

*ProteinCellassemblyandfunction/細胞組裝與功能MessengerHeadquarterExecutorStable,DNAmutationStable/Versatile,rRNA,tRNA,mRNAVersatile,ProteinmodificationProtein-ProteininteractionProtein-Othercomponentinteraction第2頁,共100頁，2024年2月25日，星期天已有超過1000個物種的基因組完成測序，大量的新基因不斷被發(fā)現(xiàn)，然而單純的基因組DNA序列尚不能解答許多生命問題?；蚴窍鄬o態(tài)的，而基因編碼的產(chǎn)物—蛋白質則是動態(tài)的，具有時空性和調節(jié)性，是生物功能的主要體現(xiàn)者和執(zhí)行者。蛋白質的表達水平、存在方式以及相互作用等直接與生物功能相關。

第3頁,共100頁，2024年2月25日，星期天蛋白質序列特點和結構蛋白質進化過程和保守序列蛋白在細胞內(nèi)的定位及其相關聯(lián)的細胞器蛋白質表達譜蛋白質翻譯后修飾情況了解與其相關聯(lián)的其他細胞蛋白質蛋白質信息的不同層次蛋白質之間的相互作用是細胞進行一切活動的基礎。第4頁,共100頁，2024年2月25日，星期天蛋白質之間相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白復合物是細胞各種基本功能的主要完成者。幾乎所有的重要生命活動，包括DNA的復制與轉錄、蛋白質的合成與分泌、信號轉導和代謝等等，都離不開蛋白質之間的相互作用。

蛋白質間相互作用研究的重要性第5頁,共100頁，2024年2月25日，星期天Humanprotein-proteininteraction(PPI)networkTowardsaproteome-scalemapofthehumanprotein–proteininteractionnetworkRual,Vidaletal.Nature437,1173-1178(2005)第6頁,共100頁，2024年2月25日，星期天

錯誤的蛋白質相互作用可能導致疾病

如Alzheimer’sdisease,beta-淀粉樣結構的堆積（alpha-synuclein與synphilin-1結合）；

Synphilin-1associateswithalpha-synucleinandpromotestheformationofcytosolicinclusions.NatGenet.1999;22(1):110-4

如尤文氏肉瘤融合蛋白（EWS-FLI1）可黏附于另一個RNA解旋A蛋白（RHA）控制基因轉錄。

AsmallmoleculeblockingoncogenicproteinEWS-FLI1interactionwithRNAhelicaseAinhibitsgrowthofEwing'ssarcoma.NatMed.2009;15(7):750-6.第7頁,共100頁，2024年2月25日，星期天蛋白質相互作用分析研究思路一、鑒定與某個感興趣的蛋白質相互作用的所有可能的蛋白質。（暫不考慮生理功能）二、詳細描述鑒定出蛋白的生物功能及相互作用對其功能的影響。（研究盡可能接近胞內(nèi)條件）三、運用高通量方法鑒定調節(jié)這種作用的關鍵因子。第8頁,共100頁，2024年2月25日，星期天等離子表面共振技術SPR免疫共沉淀Co-PIFarWesternblot串聯(lián)親和層析TAP融合蛋白沉降技術GST-PulldownInvitro酵母雙雜交YeastTwo-hybrid噬菌體展示PhagedisplayInvivo熒光共振能量轉移FRET蛋白質-蛋白質相互作用研究方法蛋白芯片ProteinChip細胞內(nèi)共定位Cellularcolocalization第9頁,共100頁，2024年2月25日，星期天

Two-hybridsystem是90年代初發(fā)展起來的新方法。在真核模式生物酵母中進行的，研究活細胞內(nèi)蛋白質相互作用，對蛋白質之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過報告基因的表達產(chǎn)物敏感地檢測得到，它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質之間關系的技術。Saccharomycescerevisiae一、酵母雙雜交系統(tǒng)

1989StanleyField’slabpublishedthefirstreportonYeastTwo-Hybridassay.FieldsS,SongO.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.Nature,1989,340(6230):245-246/sfields/yp_interactions/index.html第10頁,共100頁，2024年2月25日，星期天

酵母激活因子GAL4：

N端：147個氨基酸組成的DNA結合域(DNAbindingdomain,BD)C端：113個氨基酸組成的轉錄激活域(transcriptionactivationdomain,AD)

DNA結合域可以和上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結合，而轉錄激活域則能激活UAS下游的基因進行轉錄

。當兩者單獨存在時，不能激活轉錄；當兩者在空間上充分接近時，可以啟動下游基因的轉錄。1985MarKPatshne’slabdemonstratedmodularityofDNAbindingtranscriptionactivators.

第11頁,共100頁，2024年2月25日，星期天酵母雙雜交系統(tǒng)的原理ADYADYXDNA-BDGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergenetranscriptionGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneGAL4UASPromoterlacZ(orHIS)reportergeneXDNA-BD第12頁,共100頁，2024年2月25日，星期天誘餌蛋白（bait）BD-X與BD融合的蛋白表達載體，其表達的蛋白

靶蛋白（prey）AD-Y與AD融合的蛋白表達載體，其表達的蛋白

宿主菌株經(jīng)改造的、含一個或多個報告基因的重組質粒的宿主細胞。Componentsofthesystem載體中加入進行營養(yǎng)型篩選的基因第13頁,共100頁，2024年2月25日，星期天

基因組中GAL4基因是缺失型的

基因組也不能合成ADE、HIS、LEU、TRP（因此，酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基上無法正常生長）改造后的酵母細胞的特點：第14頁,共100頁，2024年2月25日，星期天常見報告基因通過功能互補和顯色反應篩選到陽性菌落第15頁,共100頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基類型pGADT7Amp+-LeupGBKT7Kan+-Trp單缺雙缺四缺第16頁,共100頁，2024年2月25日，星期天酵母雙雜交實驗過程第17頁,共100頁，2024年2月25日，星期天第18頁,共100頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共100頁，2024年2月25日，星期天第20頁,共100頁，2024年2月25日，星期天第21頁,共100頁，2024年2月25日，星期天用已知功能蛋白質篩選雙雜交cDNA文庫，研究蛋白質之間相互作用的傳遞途徑，發(fā)現(xiàn)新基因。繪制蛋白質相互作用系統(tǒng)圖譜(PPI)在藥物設計中的應用酵母雙雜交系統(tǒng)的應用現(xiàn)狀第22頁,共100頁，2024年2月25日，星期天1）發(fā)現(xiàn)新的蛋白質與蛋白質的新功能將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到AD-文庫載體，并從載體中進一步克隆得到隨機插入的cDNA片段，并對該片段的編碼序列在GENEBANK中進行比較，研究與已知基因在生物學功能上的聯(lián)系。

第23頁,共100頁，2024年2月25日，星期天2）構建基因組蛋白連鎖圖（GenomeProtein-proteinInteractionMap，PPI）基因組中的編碼蛋白質的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。通過基因組的測序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的基因和EST序列。利用酵母雙雜交技術，將所有已知基因和EST序列為誘餌，在表達文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖。對于認識一些重要的生命活動：如信號傳導、代謝途徑等有重要意義。第24頁,共100頁，2024年2月25日，星期天Genomeprotein-proteinInteractionmap第25頁,共100頁，2024年2月25日，星期天第26頁,共100頁，2024年2月25日，星期天第27頁,共100頁，2024年2月25日，星期天3）篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋白質之間相互作用的影響

對于能夠引發(fā)疾病反應的蛋白相互作用可采取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達到治療疾病的目的。第28頁,共100頁，2024年2月25日，星期天酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點高敏感性

①采用高拷貝和強啟動子的表達載體，使融合蛋白過量表達；②激活結構域和結合結構域結合形成轉錄起始復合物，之后又與啟動子結合，此三元復合體使融合蛋白各組分間結合更趨于穩(wěn)定；③檢測的結果是基因表達產(chǎn)物的累積效應，可檢測存在于蛋白質間的微弱或暫時的相互作用。第29頁,共100頁，2024年2月25日，星期天酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點高敏感性。真實性--檢測在活細胞內(nèi)進行，作用條件與作用力無需模擬，在一定程度上代表細胞內(nèi)的真實情況。簡潔性--融合蛋白相互作用后，減少了制備抗體和純化蛋白質的繁瑣步驟。廣泛性--采用不同組織器官細胞類型和分化時期的材料構建cDNA文庫，能分析不同亞細胞部位和功能的蛋白質。第30頁,共100頁，2024年2月25日，星期天酵母雙雜交系統(tǒng)中常見問題（一）假陽性較多（二）轉化效率偏低（三）陰性干擾第31頁,共100頁，2024年2月25日，星期天假陽性定義在待研究的兩個蛋白間沒有發(fā)生相互作用的情況下，報告基因仍被激活。（一）假陽性較多

①BD融合誘餌蛋白的單獨激活作用(自激活現(xiàn)象）②AD融合靶蛋白有DNA的特異性結合，則可單獨激活報告基因的表達。③AD融合蛋白直接與轉錄因子相互作用激活報告基因；④蛋白過表達導致非生理情況下的結合原因：第32頁,共100頁，2024年2月25日，星期天排除假陽性的措施

①

作嚴格的對照試驗。應對誘餌和靶蛋白分別作單獨激活報告基因的鑒定。--如存在自激活，雙雜交前刪除該片段，但應保留相互作用的結構域②采用多個報告基因，且每個報告基因的上游調控區(qū)各不相同。--目前多數(shù)載體已采用。進一步分析：

①

這種相互作用是否會在細胞內(nèi)自然發(fā)生。②有些蛋白依賴于泛素的蛋白酶降解途徑成員，它們具有普遍的蛋白間的相互作用。③一些實際沒有相互作用的蛋白但有相同的模體蛋白也可發(fā)生相互作用。第33頁,共100頁，2024年2月25日，星期天酵母轉化效率較細菌低4個數(shù)量級，轉化成為雙雜交技術的瓶頸。辦法：引進酵母接合型

a接合型和接合型（兩者之間可，但自身不能形成二倍體）（二）轉化效率偏低第34頁,共100頁，2024年2月25日，星期天菌落篩選藍白斑篩選第35頁,共100頁，2024年2月25日，星期天（三）陰性干擾融合蛋白的表達對細胞有毒性，該怎么辦？應選擇敏感性較低的菌株或拷貝數(shù)低的載體蛋白間的相互作用較弱，應選擇高敏感的菌株或多拷貝載體。蛋白在酵母中不能穩(wěn)定地表達，或者不能正確地折疊，或雜交蛋白不能轉入胞核。在細胞表面發(fā)生的相互作用可采用噬菌體顯示系統(tǒng)。兩個蛋白本應發(fā)生相互作用，但報告基因不表達或表達程度甚低以至于檢測不出來。原因：第36頁,共100頁，2024年2月25日，星期天

酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白-蛋白間相互作用的有效和快速的方法，有多方面的應用，但仍存在一些局限性。

雙雜交系統(tǒng)的得到的陽性結果一定要通過其它的實驗手段來驗證。酵母雙雜交系統(tǒng)使用注意事項第37頁,共100頁，2024年2月25日，星期天

在酵母雙雜交的基礎上，又發(fā)展：酵母單雜交—分析DNA和文庫蛋白之間的作用酵母三雜交--分析蛋白和RNA間的相互作用酵母的反向雜交--兩種蛋白相互作用的結構和位點。酵母雙雜交相關技術第38頁,共100頁，2024年2月25日，星期天酵母單雜交系統(tǒng)在酵母單雜交系統(tǒng)中，用特異的DNA序列取代DNAGal4結合位點。該DNA序列在相關生物系統(tǒng)中是重要的蛋白質結合位點。靶DNA序列特異的結合蛋白(BDPX)與Gal4P的激活結構域作用可激活作為表型選擇性報告基因的表達。第39頁,共100頁，2024年2月25日，星期天酵母單雜交系統(tǒng)應用①確定已知DNA-蛋白質之間是否存在相互作用。②分離編碼結合于目的順式調控元件或其他短DNA結合位點蛋白的新基因。③定位已經(jīng)證實的具有相互作用的DNA結合蛋白的DNA結合結構域。

研究DNA-蛋白質相互作用第40頁,共100頁，2024年2月25日，星期天酵母三雜交系統(tǒng)在酵母三雜交系統(tǒng)中，除RNA結合蛋白-BD和待選的RNA結合蛋白-AD，還需構建一雜合RNA，含有二個不同的蛋白結合位點。當RNA與二個RNA結合蛋白的結合位點相互作用時可激活報道基因的轉錄和表達。三雜交系統(tǒng)提供了快速、多用的體內(nèi)檢測RNA-蛋白間相互作用的新方法。。RNA第41頁,共100頁，2024年2月25日，星期天反向酵母雙雜交系統(tǒng)

（reverseyeasttwo-hybridsystem）該系統(tǒng)是一項鑒定阻斷蛋白間相互作用的技術，核心在于構建一種反向篩選的報告基因。在這系統(tǒng)中，野生型BD-X/AD-Y間的相互作用激活一種URA3報告基因，使酵母宿主-URA（ura缺失）培養(yǎng)基上生長；但URA3編碼的酶類可以使5-FOA變成對細胞有毒性的物質，使酵母細胞在含5-FOA的培養(yǎng)基上不能生長。在此情況下BD-X/AD-Y作用的解離賦予酵母一種選擇生長優(yōu)勢。利用這種方法能方便地鑒定作用缺陷等位基因、解離肽或相關的小分子物質。第42頁,共100頁，2024年2月25日，星期天-Ura5-FOA這個改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的選擇性培養(yǎng)基上只有當“誘餌”和“獵物”相互作用激活URA3基因的表達才能生長。在含有5-FOA的完全培養(yǎng)基上“餌”和“獵物”的相互作用則抑制細胞的生長。有相互作用無相互作用++--反向酵母雙雜交系統(tǒng)

（reverse

yeasttwo-hybridsystem）VidalM,BrachmannRK,FattaeyA,HarlowE,BoekeJD.Reversetwo-hybridandone-hybridsystemstodetectdissociationofprotein-proteinandDNA-proteininteractions.ProcNatlAcadSciUSA，1996，93(19):10315-10320.第43頁,共100頁，2024年2月25日，星期天反向酵母雙雜交系統(tǒng)的應用研究蛋白間作用的關鍵位點或起決定作用的個別氨基酸，進而分析蛋白結構和功能的關系。篩選能阻止某些蛋白間相互作用的肽或小分子物質用作臨床治療制劑。利用反向雙雜交系統(tǒng)對文庫進行預清除，則可能大大減輕以后的假陽性鑒定工作。反向雙雜交系統(tǒng)作為正向雙雜交系統(tǒng)的補充，提出了創(chuàng)建整個有機體蛋白質連鎖圖譜的設想。第44頁,共100頁，2024年2月25日，星期天細菌雙雜交：操作簡單，周期短2-3天可研究膜蛋白或跨膜蛋白相互作用哺乳細胞雙雜交：蛋白有翻譯后修飾，可正確地折疊報告基因：熒光素酶，堿性磷酸酶和

-半乳糖苷酶酵母雙雜交相關技術第45頁,共100頁，2024年2月25日，星期天Figure.Schemaofthehigh-throughputyeasttwo-hybridpipeline.Nature.2005Oct20;437(7062):1173-8.Towardsaproteome-scalemapofthehumanprotein-proteininteractionnetwork.Example第46頁,共100頁，2024年2月25日，星期天theleaderinenzymetechnology二、噬菌體展示技術是一項篩選技術，將目標蛋白的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，使外源多肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白融合表達，融合蛋白展示在病毒顆粒的表面。被展示的多肽或蛋白質可保持相對獨立的空間結構和生物學活性。Smith在1985年首次證實外源DNA可以插入絲狀噬菌體基因III中，并與pIII蛋白融合展示。

SmithGP.Science1985;228:1315-7/smithgp/PhageDisplayWebsite/PhageDisplayWebsiteIndex.html第47頁,共100頁，2024年2月25日，星期天展示系統(tǒng)不同分為：M13噬菌體展示系統(tǒng)、T7噬菌體、T4噬菌體與

-噬菌體展示系統(tǒng)噬菌體展示系統(tǒng)的分類：絲狀噬菌體蝌蚪形噬菌體λ噬菌體、T4噬菌體、T7噬菌體M13噬菌體第48頁,共100頁，2024年2月25日，星期天展示內(nèi)容（文庫）不同包括：隨機肽段文庫、天然肽段文庫、cDNA文庫、抗體文庫（抗體片段）、蛋白質文庫等噬菌體展示系統(tǒng)的分類：第49頁,共100頁，2024年2月25日，星期天theleaderinenzymetechnologyLifeCycleofM13

以dsDNA為模版合成所有的病毒蛋白，且通過滾環(huán)復制合成組裝病毒所需的ssDNA。

基因組編碼11種蛋白質，其中5種為結構蛋白質。與展示密切相關的有兩種結構蛋白質（主要衣殼蛋白pVIII和次要衣殼蛋白pIII）。

感染宿主后通常不裂解宿主細胞，而是從感染的細胞中分泌出噬菌體顆粒，第一代噬菌體在感染10分鐘后出現(xiàn)在培養(yǎng)液中（37oC）。感染后1小時內(nèi)平均每個細胞分泌1000個噬菌體。第50頁,共100頁，2024年2月25日，星期天theleaderinenzymetechnology主要衣殼蛋白pVIII和次要衣殼蛋白pIIIPIIIPVIII展示多肽～300aa<10aa展示數(shù)量低價（約5個拷貝）高價（高達2700個拷貝）配體結合力親和力非常低高親和力插入部位N端、近N端或N端與C端的柔性連接區(qū)融合N端或近N端融合衣殼蛋白第51頁,共100頁，2024年2月25日，星期天GeneralselectionschemeforcDNAexpression-productsdisplayedonphagesurface.Konthuretal2003TARGETSVol.2,No.6261-270.噬菌體展示操作流程第52頁,共100頁，2024年2月25日，星期天噬菌體展示技術的優(yōu)點非展示系統(tǒng)展示系統(tǒng)第53頁,共100頁，2024年2月25日，星期天噬菌體展示技術的優(yōu)點特定分子的基因型和其表型統(tǒng)一在同一個噬菌體顆粒內(nèi)，將重組蛋白質篩選與基因篩選合二為一。被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結構和生物活性，以利于靶分子的識別和結合。淘選的高效率使陽性克隆在微量存在的情況下，通過感染得到擴增富集。操作簡單易行，在幾周內(nèi)即可篩選106～108克隆噬菌體隨機肽庫具有容量大、體積小、篩選簡便、制備成本低、可多次擴增等突出優(yōu)點。第54頁,共100頁，2024年2月25日，星期天噬菌體展示技術的局限性所建庫的容量（109）和分子多樣性受到限制；噬菌體展示文庫一旦建成，很難再進行有效的體外突變和重組，進而限制了文庫中分子遺傳的多樣性。由于噬菌體展示系統(tǒng)依賴于細胞內(nèi)基因的表達，所以，一些對細胞有毒性的分子如生物毒素分子，很難得到有效表達和展示。少數(shù)多肽由于疏水性，或由于影響外膜蛋白的折疊而不能展示在噬菌體表面。第55頁,共100頁，2024年2月25日，星期天噬菌體展示的應用????抗原表位分析蛋白質相互作用位點的確定人工抗體和疫苗的制備酶抑制劑的研究開發(fā)多肽藥物的研制第56頁,共100頁，2024年2月25日，星期天TargetingPlasmodiumligandsonmosquitosalivaryglandsandmidgutwithaphagedisplaypeptidelibraryProcNatlAcadSciUSA.2001;98(23):13278–13281.Figure1.Schematicillustrationoftheselectionprotocolforphagesthatbindeithertosalivaryglands(a)ortotheluminalsideofthemidgutepithelium(b).Example第57頁,共100頁，2024年2月25日，星期天三、熒光共振能量轉移(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)

當供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個分子的距離在10nm范圍以內(nèi)時，就會發(fā)生一種非放射性的能量轉移，即FRET現(xiàn)象，使得供體的熒光強度比它單獨存在時要低的多（熒光猝滅），而受體發(fā)射的熒光卻大大增強（敏化熒光）。FRET技術是目前唯一能對固定細胞中的蛋白質間相互作用或存在于活細胞蛋白質間相互作用，提供定位和定量信息的技術。第58頁,共100頁，2024年2月25日，星期天FRET熒光能量轉移第59頁,共100頁，2024年2月25日，星期天FRET熒光能量轉移有三個基本條件：給體與受體在合適的距離（1～10nm）；給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有一定的重疊（這是能量匹配的條件）；給體與受體的偶極具有一定的空間取向（這是偶極-偶極耦合作用的條件）。第60頁,共100頁，2024年2月25日，星期天

1)熒光蛋白:

一類能發(fā)射熒光的天然蛋白及其突變體。

BFP/GFP,CFP/YFP.

常用的探針

ColordefiningGFPBlue(BFP)Green(GFP)Cyan(CFP)Yellowish(YFP)Red(D.s.RFP)Excitation(max)382nm434nm488nm514nm558nmEmission(max)446nm476nm509nm527nm583nmSensitivitytophotobleachingHighLowLowModerateLow第61頁,共100頁，2024年2月25日，星期天

2)傳統(tǒng)有機染料:

具有特征吸收和發(fā)射光譜的有機化合物組成的染料對。包括熒光素和青色染料Cy3/Cy5等。（優(yōu)先選擇）

3)鑭系染料:

稀土染料,一般與有機染料聯(lián)用，分別作為FRET的供體和受體，以提高檢測的準確性和信噪比。

4)量子點:

量子點是一種能接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光的納米顆粒。激發(fā)和放射光譜寬，

發(fā)射熒光強（20倍），穩(wěn)定（100倍）。常用的探針

第62頁,共100頁，2024年2月25日，星期天FRET常見的供體-受體熒光分子對：熒光蛋白類：染料類：CFP-YFPBFP-GFPBFP-YFPCFP-DsRFPGFP-DsRFPCFP-YFP-mCherry第63頁,共100頁，2024年2月25日，星期天均相檢測（無分離和洗滌步驟）實時連續(xù)地觀察活細胞的動態(tài)變化FRET技術的優(yōu)勢和缺點FluorescenceIntensityTime

LigandCy3Cy5熒光強度隨時間衰減，有時間限制；采集信號有噪音缺點：第64頁,共100頁，2024年2月25日，星期天

假陰性問題

轉染效率，尤其是目標蛋白是膜蛋白時配對的供體和受體之間距離和方向不合適，即便形成復合物，F(xiàn)RET也不會產(chǎn)生；

儀器的敏感度、分辨率、及影像采集和分析能力

假陽性的問題

沒有相互作用的供體和受體之間相隔很近的話，也可以發(fā)生FRET；

所以，應結合多種蛋白相互作用的研究方法（如免疫共沉淀）

FRET熒光能量轉移應注意問題：第65頁,共100頁，2024年2月25日，星期天FRET應用范圍

酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體展示系統(tǒng)所篩選克隆的復證蛋白質—核酸相互作用酶活性分析 離子通道研究蛋白質的結構研究第66頁,共100頁，2024年2月25日，星期天TechniqueExtension-

Bimolecularfluorescencecomplementation

(BiFC,雙分子熒光互補技術)

AVisualSystemtoInvestigateProtein-ProteinInteractionsBiFC技術是將熒光蛋白（GFP、YFP、CFP）分割成兩個不具有熒光活性的分子片段，再分別與目標蛋白連接。如果兩個目標蛋白因為有相互作用而接近，就使得熒光蛋白的兩個分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基因而發(fā)出熒光。在熒光顯微鏡下，就能直接觀察到兩目標蛋白是否具有相互作用，對研究蛋白質相互作用有重要意義。Huetal.,Mol.Cell9,789–798(2002).第67頁,共100頁，2024年2月25日，星期天可以在最接近活細胞生理狀態(tài)的條件下觀察到相互作用的蛋白發(fā)生的時間、位置、強弱、所形成蛋白復合物的穩(wěn)定性，以及細胞信號分子對其相互作用的影響等。第68頁,共100頁，2024年2月25日，星期天四、細胞內(nèi)共定位實驗

(Cellularlocalization)直觀，可以看到兩種有相互作用的蛋白質在細胞內(nèi)的分布以及共定位的部位

蛋白質細胞內(nèi)定位結果較為直觀地反應蛋白在細胞內(nèi)的活動狀態(tài)

第69頁,共100頁，2024年2月25日，星期天有色熒光蛋白標記技術步驟也可稱為活細胞定位分別克隆X，Y至熒光蛋白載體中共轉染表達GFP/RFP融合蛋白confocalmicroscopy共聚焦顯微鏡法第70頁,共100頁，2024年2月25日，星期天第71頁,共100頁，2024年2月25日，星期天檢測細胞內(nèi)源性蛋白的定位及相互作用一抗，二抗（熒光素標記）“靶蛋白一抗二抗”免疫復合物對照的嚴格設置利用雙色或多色染色的免疫熒光技術進行蛋白定位步驟第72頁,共100頁，2024年2月25日，星期天第73頁,共100頁，2024年2月25日，星期天其它研究方法的基本原理第74頁,共100頁，2024年2月25日，星期天五、融合蛋白沉降技術

(如：GSTPulldown)

利用GST對谷胱甘肽偶聯(lián)的瓊脂糖球珠的親和性，從混合蛋白質樣品中純化得到相互作用蛋白。第75頁,共100頁，2024年2月25日，星期天GSTpulldown第76頁,共100頁，2024年2月25日，星期天一確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間的新的相互作用；一是鑒定兩個已知蛋白質之間是否存在相互作用。融合蛋白沉降技術的應用第77頁,共100頁，2024年2月25日，星期天

操作簡便，如果用抗GST抗體檢測或生物素標記融合蛋白避免了使用同位素等危險物質。

融合蛋白具有高通量性、高選擇性的特點，由于融合蛋白的多樣性以及表達系統(tǒng)的多樣性(如細菌、果蠅、哺乳動物)，該方法能夠研究蛋白質在復雜體系中的相互作用。

融合蛋白沉降技術的優(yōu)點第78頁,共100頁，2024年2月25日，星期天該方法的成功應用取決于是否能夠得到足夠多，并且保持蛋白質活性的重組融合蛋白。

只用于確定體外的相互作用，還應當在體內(nèi)用單獨的方法，如免疫共沉淀加以證實。

此方法常用來驗證酵母雙雜交試驗所得到的相互作用。融合蛋白沉降技術的局限性第79頁,共100頁，2024年2月25日，星期天

利用抗原抗體作用的專一性為基礎?？捎糜阼b定兩種興趣蛋白質是否在體內(nèi)存在相互作用；也用于鑒定一個特定蛋白質的未知相互作用蛋白。六、免疫共沉淀技術Co-immunoprecipitation(Co-IP)第80頁,共100頁，2024年2月25日，星期天免疫共沉淀YABAYBY非生理性結合生理性結合非特異性結合原理：細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質－蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質x的抗體免疫沉淀x，那么與x在體內(nèi)結合的蛋白質y也能沉淀下來。第81頁,共100頁，2024年2月25日，星期天實驗的關鍵1、

實驗最需要注意點就是抗體的性質。2、為防止蛋白的分解、修飾，溶解抗原的緩沖液必須使用蛋白酶抑制劑，低溫下(4C)進行實驗。合理設置對照，避免非特異性結合。使用對照抗體：鼠單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗兔多克隆抗體：正常兔IgG第82頁,共100頁，2024年2月25日，星期天優(yōu)點：1、相互作用的蛋白質都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；2、蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為的影響；缺點：1、可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質相互作用；2、兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，可能有第三者在中間起橋梁作用；

3、如用westernblot檢驗，必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體。免疫共沉淀技術的優(yōu)缺點第83頁,共100頁，2024年2月25日，星期天PlasmidsconstructTranscription;Translation;MixtranslatedproductsIncubationwith

ONEantibodyElutionandseparationwithSDSAnti-cMycAnti-HA用免疫共沉淀(Co-IP)技術驗證酵母雙雜交獲得的結果第84頁,共100頁，2024年2月25日，星期天1999年Rigaut等人共同提出了一套分離復合蛋白的新方法—串聯(lián)親和純化(Tandemaffinitypurification，TAP)，兼具標準親和純化（可以得到高純度地拷貝數(shù)的蛋白質復合體）和免疫共沉淀（用于特異性的標記蛋白與親和柱之間的相互作用）兩種生化方法的優(yōu)點，為蛋白質復合體的分離鑒定提供了一條新路徑。

適用于：研究蛋白質復合體中多個蛋白質間的相互作用，特別適用于研究蛋白質在生理條件下的相互作用七、串聯(lián)親和層析TAP第85頁,共100頁，2024年2月25日，星期天RigautGetal.,NatureBiotechnology17,1030-1032(1999)串聯(lián)親和層析靶蛋白結合于IgG珠子充分洗滌后，在TEV蛋白酶作用下洗脫結合物鈣離子存在下，將首次洗脫物中的蛋白質結合于鈣調蛋白包被的珠子上充分洗滌后，加入EGTA洗脫結合物第86頁,共100頁，2024年2月25日，星期天TAP中常用標簽第87頁,共100頁，2024年2月25日，星期天

TAP優(yōu)點：1、相互作用發(fā)生在天然環(huán)境和細胞部位，可以分離和分析多組分的復合物。2、標簽的高度特異性以及采用兩步洗脫純化法，可以更好地保持較不穩(wěn)定的蛋白質復合物，降低非特異蛋白的結合。3、步驟簡單、可量化、可獲得大量蛋白質。TAP缺點：1、傾向于分離高豐度和穩(wěn)定的相互作用蛋白，許多低親和力、瞬時和依賴特殊細胞環(huán)境的相互作用可能檢測不到。2、必須采用TAP標簽的蛋白，在哺乳動物細胞中，高于生理水平的誘餌蛋白而產(chǎn)生假陽性。

第88頁,共100頁，2024年2月25日，星期天TAP與質譜結合（TAP-MS)第89頁,共100頁，2024年2月25日，星期天核糖體蛋白代謝酶類熱休克蛋白泛肽酶高豐度的細胞骨架蛋白血清蛋白（如果使用是IP親和的方式）MSafteraffinitypurification鑒定結果中通常包含很多非特異的蛋白質信息去除這