關(guān)于生物敏感膜的制備2第一節(jié)生物敏感膜

敏感膜的構(gòu)成：

膜基體

膜材料

生物敏感材料第2頁,共76頁，2024年2月25日，星期天31、膜基體

膜基體是敏感膜的載體，它關(guān)系著有效發(fā)揮敏感材料的作用和膜的壽命，也即生物傳感器的使用壽命。常用的膜基體有：金屬材料，如鉑、金、鈀等；半導(dǎo)體材料，如石英、玻璃、氮化硅、硅、鍺等；有機(jī)材料，如聚氯乙烯、硅橡膠、

纖維素等。第3頁,共76頁，2024年2月25日，星期天42、膜材料

膜材料是固化敏感材料成膜的物質(zhì)，是敏感材料的支持物。它必須具有一定的剛性和韌性，要適合于敏感材料的搭載與結(jié)合；它必須具有化學(xué)或物理附著力，以利于固化在膜基體上。第4頁,共76頁，2024年2月25日，星期天5膜材料包括有四類：⑴有機(jī)聚合物類：如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚氟乙烯、葡聚糖、硅橡膠等；⑵無機(jī)物類:如多孔玻璃、活性炭、石墨、石英、硫化物、粘土等；⑶天然生物材料類：如瓊脂、動(dòng)植物細(xì)胞膜、卵磷脂等；⑷人工合成的生物材料類：如各種兩親有機(jī)化合物構(gòu)成的雙層脂膜，如磷脂。第5頁,共76頁，2024年2月25日，星期天63、生物敏感材料

生物敏感材料是生物傳感器的核心，有人稱它為分子探針。常用的生物敏感材料有：酶、微生物(病毒、細(xì)菌)、動(dòng)植物組織、化學(xué)和生物發(fā)光物質(zhì)、抗體和受體、DNA等生物敏感組分。第6頁,共76頁，2024年2月25日，星期天7具體方式有四種：

⑴膜基體——膜材料——敏感材料

⑵膜基體——膜材料＋敏感材料

⑶膜基體（膜材料）——敏感材料

⑷膜基體＋敏感材料第7頁,共76頁，2024年2月25日，星期天8第二節(jié)生物敏感材料的

固定化技術(shù)

生物敏感膜的制備技術(shù)就是將生物活性物質(zhì)進(jìn)行固定化的技術(shù)，它是生物傳感器研究的重要內(nèi)容。

第8頁,共76頁，2024年2月25日，星期天9

固定化目的：

◆將生物活性物質(zhì)限制在一定的空間，同時(shí)不妨礙底物的自由擴(kuò)散。

第9頁,共76頁，2024年2月25日，星期天游離相的生物活性材料固相載體固相生物活性材料（eg：固定化酶）固定化技術(shù)第10頁,共76頁，2024年2月25日，星期天11固定化技術(shù)應(yīng)滿足：

◆固化后的生物組分仍能維持良好的生物活性；

◆固定化層要有良好的穩(wěn)定性和耐用性，且能適應(yīng)多種測試環(huán)境；

第11頁,共76頁，2024年2月25日，星期天12

生物敏感物質(zhì)的固定化方法，大致劃分為吸附法、包埋法、夾心法、共價(jià)鍵固定法、交聯(lián)法。第12頁,共76頁，2024年2月25日，星期天13一、吸附法

吸附法是用非水溶性載體物理吸附或離子結(jié)合，使生物組分固定在其表面的方法。

包括：物理吸附

離子交換吸附第13頁,共76頁，2024年2月25日，星期天14㈠物理吸附法

物理吸附法主要通過范德華力的作用將生物組分吸附在水不溶性的惰性載體上。

常用載體有多孔玻璃、活性炭、氧化鋁、石英砂、纖維素膜、葡聚糖、瓊脂糖等，

第14頁,共76頁，2024年2月25日，星期天15優(yōu)點(diǎn)：

操作簡便、條件溫和，不會(huì)引起生物組分的變性失活，載體廉價(jià)易得，而且可反復(fù)使用。缺點(diǎn)：對(duì)周圍環(huán)境敏感，結(jié)合力弱，生物組分容易脫落。

第15頁,共76頁，2024年2月25日，星期天16（二）離子交換吸附法

選用具有離子交換的載體，使生物組分與離子交換劑通過離子鍵結(jié)合，形成固定化層。

常用載體有離子交換樹脂、二乙胺乙基纖維素、四乙胺乙基纖維素、氨乙基纖維素、羧甲基纖維素等。

制備的固定化酶有葡萄糖淀粉酶、膽固醇氧化酶等。

第16頁,共76頁，2024年2月25日，星期天離子交換樹脂的結(jié)構(gòu)具有三維空間立體結(jié)構(gòu)的網(wǎng)絡(luò)骨架聯(lián)接在骨架上的活性基團(tuán)活性基團(tuán)帶有可交換的活性離子第17頁,共76頁，2024年2月25日，星期天二、夾心法

將生物活性材料封閉在雙層濾膜之間。

特點(diǎn)：

操作簡單，不需要任何化學(xué)處理，固定生物量大，響應(yīng)速度快，重現(xiàn)性好，尤其適用于微生物和組織膜的制作。

第18頁,共76頁，2024年2月25日，星期天舉例微生物膜制備的一般步驟:①將微生物培養(yǎng)離心，洗滌，懸浮；②測定菌體濃度；③取一定量的菌懸液滴到濾膜上；④將水抽干，使菌體成一薄層均勻附著于膜表面；⑤在菌體層上覆蓋一層透氣膜或微孔濾膜，讓微生物夾在兩層膜之間。第19頁,共76頁，2024年2月25日，星期天BOD（生化需氧量）微生物傳感器結(jié)構(gòu)示意圖第20頁,共76頁，2024年2月25日，星期天

BOD微生物傳感器的電流響應(yīng)

第21頁,共76頁，2024年2月25日，星期天22三、包埋法

包埋法是將生物組分包埋并固定在高分子聚合物三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)基質(zhì)中，形成穩(wěn)定生物組分敏感膜。

第22頁,共76頁，2024年2月25日，星期天23優(yōu)點(diǎn)：

◆可采用溫和的實(shí)驗(yàn)條件及多種凝膠聚合物；

◆對(duì)生物組分的活性影響較??；

◆可固定高濃度的生物組分,被包埋物不易滲漏等。第23頁,共76頁，2024年2月25日，星期天24缺點(diǎn)：

◆分子量大的底物在凝膠網(wǎng)格內(nèi)擴(kuò)散較困難，響應(yīng)速度較慢；

◆若載體是合成凝膠，在聚合物形成過程中對(duì)生物組分的活性可能產(chǎn)生影響。第24頁,共76頁，2024年2月25日，星期天25包埋法包括三種：

聚合物膜包埋法

電聚合物膜包埋法

溶膠-凝膠包埋法

第25頁,共76頁，2024年2月25日，星期天26㈠聚合物膜包埋法

將生物組分與聚合物單體混合而使生物組分包埋于其中，制備成具有生物活性的敏感膜。

第26頁,共76頁，2024年2月25日，星期天27㈡電聚合物膜包埋法

將聚合物單體和生物活性物質(zhì)同時(shí)混合于電解液中，通電使單體在電極表面氧化而聚合成膜，同時(shí)將生物活性物質(zhì)包埋于聚合物膜內(nèi)，直接固定于電極表面，構(gòu)成生物傳感器。

第27頁,共76頁，2024年2月25日，星期天28優(yōu)點(diǎn)：●聚合層厚度和酶量容易控制●修飾層重現(xiàn)性好。第28頁,共76頁，2024年2月25日，星期天29㈢溶膠-凝膠膜包埋法⑴溶膠-凝膠(sol-gel)技術(shù)指有機(jī)或無機(jī)化合物經(jīng)過溶液、溶膠、凝膠而固化，再經(jīng)過熱處理制得氧化物或其它化合物固體的方法。第29頁,共76頁，2024年2月25日，星期天30

溶膠（Sol）：是具有液體特征的膠體體系，分散的粒子是固體或者大分子，直徑在1-100nm之間。。凝膠（Gel）：是具有固體特征的膠體體系，被分散的物質(zhì)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。第30頁,共76頁，2024年2月25日，星期天31溶膠無固定形狀粒子自由運(yùn)動(dòng)凝膠固定形狀粒子按一定網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)固定不能自由運(yùn)動(dòng)溶膠與凝膠的結(jié)構(gòu)比較第31頁,共76頁，2024年2月25日，星期天溶膠-凝膠的典型例子：豆?jié){（sol）豆腐（gel）第32頁,共76頁，2024年2月25日，星期天33（2）溶膠—凝膠的制備

●金屬或半金屬醇鹽在水、互溶劑（一般為醇）及催化劑（酸或堿）發(fā)生水解反應(yīng)，形成羥基化的產(chǎn)物和相應(yīng)的醇。

●未羥基化的烷氧基與羥基或兩羥基間發(fā)生縮合形成膠體狀的混合物，即溶膠，水解和縮合過程同時(shí)進(jìn)行；

●最后膠粒間發(fā)生聚合、交聯(lián)，使溶膠黏度逐漸增大，形成凝膠。第33頁,共76頁，2024年2月25日，星期天34

第34頁,共76頁，2024年2月25日，星期天35第35頁,共76頁，2024年2月25日，星期天

硅烷聚合物凝膠的立體構(gòu)造

第36頁,共76頁，2024年2月25日，星期天37

圖溶膠-凝膠法包埋活性分子的過程

溶膠—凝膠法包埋生物活性分子通常只是物理結(jié)合過程。溶膠溶液將活性分子加入溶膠溶液凝膠開始形成活性分子被包埋在凝膠中。

第37頁,共76頁，2024年2月25日，星期天38（3）溶膠—凝膠法的特點(diǎn)光學(xué)透光性強(qiáng)；無電化學(xué)降解，具有導(dǎo)電性且易控制；熱穩(wěn)定性好，具有化學(xué)惰性；具有一定的剛性；有足夠的水，為生物組分提供水溶液的微環(huán)境；能均勻地?fù)饺肷锝M分，實(shí)現(xiàn)分子水平上的均勻摻雜。第38頁,共76頁，2024年2月25日，星期天39四、共價(jià)鍵固定法

將生物組分通過共價(jià)鍵與不溶性載體（轉(zhuǎn)換器探頭）結(jié)合而固定的方法稱共價(jià)鍵固定法，或稱載體結(jié)合法。

包括3個(gè)步驟：

●基底電極表面的活化

●生物分子的偶聯(lián)

●剩余價(jià)鍵的封閉及除去鍵合疏松的組分。第39頁,共76頁，2024年2月25日，星期天載體修飾需滿足：

●化學(xué)連接穩(wěn)定●連接長度足夠長，減小固相表面的空間位阻●不產(chǎn)生非特異性結(jié)合第40頁,共76頁，2024年2月25日，星期天41

(1)直接化學(xué)固定法

將基體表面先經(jīng)過化學(xué)處理或修飾，然后將生物功能物質(zhì)以共價(jià)、離子或配位等方式結(jié)合固定于電極表面。第41頁,共76頁，2024年2月25日，星期天42（2）硅烷化-雙功能基團(tuán)試劑偶聯(lián)法

采用硅烷化試劑修飾基體表面，使其帶上氨基或羥基，然后用雙功能偶聯(lián)劑（如戊二醛）與生物活性分子相結(jié)合而使生物組分固定的方法。第42頁,共76頁，2024年2月25日，星期天43硅烷化—雙功能基團(tuán)試劑偶聯(lián)法第43頁,共76頁，2024年2月25日，星期天44⑶自組裝（Selfassembling，SA）膜法

基于分子的自組裝作用，在固體表面上自然地形成高度有序的單分子層的方法。有些分子通過化學(xué)鍵相互作用能自發(fā)吸附在固/液和固/氣表面，形成熱力學(xué)穩(wěn)定和能量最低的有序膜。

第44頁,共76頁，2024年2月25日，星期天發(fā)生自組裝的條件：

動(dòng)力：提供能量

導(dǎo)向作用：分子在空間的大小和方向上達(dá)到分子重新排列的要求，從無序到有序的重新重組。自組裝單層膜的形成示意圖第45頁,共76頁，2024年2月25日，星期天46自組裝膜的類型：●脂肪酸在金屬氧化物表面●有機(jī)硅烷在羥基化表面(Si02／Si、A12O3／Al、玻璃等)

●硫醇、二硫化物和硫化物在金屬（金、銀、銅）表面或半導(dǎo)體表面第46頁,共76頁，2024年2月25日，星期天47自組裝膜的結(jié)構(gòu)：●頭基：與基底表面上的反應(yīng)以共價(jià)鍵或離子鍵結(jié)合?！裢榛湥罕砻婊钚晕镔|(zhì)在固體表面有序緊密地排列。

●末端基團(tuán)：如-CH3，-COOH,-OH,-NH2，-SH。第47頁,共76頁，2024年2月25日，星期天載體活化的方法48重氮法疊氮法溴化氰法縮合法烷基化法第48頁,共76頁，2024年2月25日，星期天49(1)重氮法

●芳香族伯胺和亞硝酸作用（在強(qiáng)酸介質(zhì)下）生成重氮鹽的反應(yīng)稱為重氮化。重氮基再與酶分子中的-NH2、-OH、-SH、咪唑基等發(fā)生重氮偶聯(lián)反應(yīng)，從而制成固定化酶。

第49頁,共76頁，2024年2月25日，星期天第50頁,共76頁，2024年2月25日，星期天51●對(duì)纖維素等多糖類不溶性載體,可利用于硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)，一端與纖維素上的羥基進(jìn)行醚化，另一端上的-NH2，經(jīng)NaNO2與HCl重氮化，重氮基再與酶偶聯(lián)。

第51頁,共76頁，2024年2月25日，星期天第52頁,共76頁，2024年2月25日，星期天53（2）疊氮法

將含羧基的不溶性載體(如羧甲基纖維素、膠原蛋白等)進(jìn)行甲酯化，再與肼基作用生成含有酰肼基團(tuán)的載體，再與亞硝酸活化，生成疊氮化合物,最后與酶上的-NH2偶聯(lián)。第53頁,共76頁，2024年2月25日，星期天第54頁,共76頁，2024年2月25日，星期天55(3)溴化氫法

將具有-OH的不溶性載體，首先用CNBr活化，形成具有活性的亞胺碳酸衍生物，再與酶上的-NH2偶聯(lián)。第55頁,共76頁，2024年2月25日，星期天56第56頁,共76頁，2024年2月25日，星期天(4)縮合法（肽鍵法）

酶的-NH2或-COOH與載體的-COOH或-NH2形成肽鍵，從而制得固定化酶。第57頁,共76頁，2024年2月25日，星期天58(5)烷基化法

使酶分子中-NH2、-SH、酚基與不溶性載體上的鹵素或乙烯磺?；l(fā)生反應(yīng)，制成固定化酶；也可以使聚酰胺類化合物先經(jīng)硫酸二甲酯烷基化后，烷氧基再與酶中的-NH2、-SH、酚基等作用，制備固定化酶。

第58頁,共76頁，2024年2月25日，星期天含羥基的載體可用鹵代物進(jìn)行活化，形成含有鹵素基團(tuán)的活化載體。第59頁,共76頁，2024年2月25日，星期天60㈢交聯(lián)共聚法

借助于交聯(lián)劑(具有兩個(gè)或兩個(gè)以上功能基的試劑)的作用，使酶分子間發(fā)生共價(jià)結(jié)合，形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固相酶，也可將酶分子直接與載體共價(jià)交聯(lián)。第60頁,共76頁，2024年2月25日，星期天61

共價(jià)鍵結(jié)合法的特點(diǎn)是結(jié)合牢固，蛋白質(zhì)分子不易脫落，載體不易被生物降解，使用壽命長。缺點(diǎn)是操作步驟比較麻煩，酶活性可能因?yàn)榘l(fā)生化學(xué)修飾而降低，制備具有高活性的固定化酶比較困難。第61頁,共76頁，2024年2月25日，星期天62尼龍網(wǎng)酶膜的制備：1）活化尼龍網(wǎng)在硫酸二甲酯中煮沸5分鐘；2）洗滌移入無水甲醇3）連接氨基轉(zhuǎn)移到賴氨酸溶液中反應(yīng)2h，用NaCl清洗；4）加交聯(lián)劑戊二醛；5）與酶交聯(lián)。第62頁,共76頁，2024年2月25日，星期天63五、LB(Langmuir-Blodgett)膜法（一）LB膜

把液面上有序排列的有機(jī)化合物逐層地轉(zhuǎn)移到固定基片上，在分子水平上制造出按有序排列的分子組合體，成為單分子層或幾個(gè)多分子層的修飾薄膜。

第63頁,共76頁，2024年2月25日，星期天64（二）LB膜的特點(diǎn)1.膜厚度可精確控制，可精確到納米級(jí)；2.膜內(nèi)分子排列有序而致密，均一性好；3.脂質(zhì)雙層膜同生物膜結(jié)果相似，是理想的仿生膜，具有極佳的生物相容性；4.可把活性物質(zhì)固定在LB膜的預(yù)定位置，制成具有特殊功能的生物傳感器。第64頁,共76頁，2024年2月25日，星期天制備LB膜的裝置示意圖

（三）LB膜的制備過程及制備方式第65頁,共76頁，2024年2月25日，星期天制膜過程示意圖第66頁,共76頁，2024年2月25日，星期天67按照轉(zhuǎn)移（掛膜）式電極表面相對(duì)于水面的相對(duì)運(yùn)動(dòng)方向，可將LB膜的制備分為X,Y和Z三種方式。第67頁,共76頁，2024年2月25日，星期天68X法：將電極表面垂直