進(jìn)出口紡織品中山羊絨和綿羊毛的鑒別PCR法和實(shí)時(shí)熒光PCR法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了紡織品中山羊絨，綿羊毛鑒別的PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于紡織品中山羊絨、綿羊毛PCR法和實(shí)時(shí)熒光PCR法的定性鑒別。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction:PCR一種模擬天然DNA復(fù)制的體外擴(kuò)增法，在DNA聚合酶催化下。以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，以4種單核苷酸(dNTP)為底物，通過變性一退火一延伸的循環(huán)反應(yīng)，使極少量的DNA的特定片段，在短短幾小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增上百萬(wàn)信。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量或定性分析的方法。下列縮略語(yǔ)適用于本文件。bp:堿基對(duì)(basepair)Ct值；每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閥值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(eyclethreshold)DNA;脫氧核糖核酸(deoxyribonuleicacid)DTT;二硫疏糖醇。dNTP:脫氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate)用試劑盒法提取樣品DNA。針對(duì)山羊、綿羊的線粒體DNA序列設(shè)計(jì)引物和探針，通過單一PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，對(duì)DNA中的山羊成分、綿羊成分分別進(jìn)行特異性擴(kuò)增，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，判定該樣品中是否含有山羊絨、綿羊毛。6.1實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)格。6.2組織和毛發(fā)提取試劑盒(與DNA1QT”系統(tǒng)結(jié)合使用):參見附錄A中A.1?！?.32×TagPCRMasterMix;0.1U/pL.TagDNA聚合酶，500gmol/L(pH8.3),100mmol/L.KCl,3mmol/L.MgCl,其他穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑，-20℃保存。6.4PremirErTag'"(PerfertRenlTime6.6瓊脂糖。6.7溴化乙錠。6.105×TBE緩沖液。7儀器與設(shè)備7.1冰箱：4℃~-20℃。7.2天平：感量0.001g。7.3分析研磨機(jī)。7.5微孔干溶器或水溶鍋。7.6瞬時(shí)離心機(jī)。7.7潤(rùn)旋儀。7.81.5mL磁分離架。7.9微量可調(diào)移液器及槍頭：10μl、207.101.5mL離心管。7.11PCR薄壁管。7.12實(shí)時(shí)熒光PCR光學(xué)反應(yīng)管。7.13超凈工作臺(tái)。7.15實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。7.16電泳裝置。7.17凝膠成像儀。紗線：從不同的管紗，簡(jiǎn)紗或絞紗上隨機(jī)取樣，共取約1g的紗樣。織物：從不同位置剪取，共取約1g的織物?！鎯?nèi)參基因5*-GCG/ATACGCAATCTTACGA5°-CTGG/TCCTCCAATTCATG℃5*-ATATCAACACACGAGAGG5°-TTTAAACTGGAGAGTGG11.2.2PCR反應(yīng)體系2×TagPCRMasterMix12.5pL,10pmol/L引物各0.5pL,DNA模11.2.3PCR反應(yīng)條件94℃,5min;94℃,30s.退火溫度(表1),30s,72℃,30s,40個(gè)循環(huán)：72℃,5min。11.2.4PCR產(chǎn)物的檢測(cè)將適量5×TBE稀釋成0.5×TBE溶液，配制2.0%瓊脂糖凝膠。取15μLPCR產(chǎn)物，點(diǎn)樣進(jìn)行電泳，并加DNAmarker點(diǎn)樣以判斷PCR產(chǎn)物的片段大小。電壓大小根據(jù)電泳槽長(zhǎng)度來(lái)確定，一般控制在3V/cm~5V/cm長(zhǎng)度，電泳時(shí)間根據(jù)溴酚監(jiān)的移動(dòng)位置來(lái)確定。電泳結(jié)束后，將凝膠置溴化乙錠溶液(10pg/gL)中浸泡30min。用凝膠成像系統(tǒng)觀察，拍照，記錄與分析電泳結(jié)果。11.2.5PCR結(jié)果及判斷陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照均未出現(xiàn)條帶；待測(cè)樣品末出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，判斷結(jié)果為陰性。待測(cè)樣品出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，判斷結(jié)果為可疑陽(yáng)性，需進(jìn)一步確證。11.2.6結(jié)果確證實(shí)驗(yàn)可疑陽(yáng)性結(jié)果的，可委托有資質(zhì)的生物技術(shù)公司對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，所獲得的序列與附錄B中的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，同源率達(dá)100%,可確證為陽(yáng)性結(jié)果，或采用實(shí)時(shí)熒光PCR法進(jìn)行確證。11.3實(shí)時(shí)熒光PCR法11.3.1引物及探針?biāo)玫囊?，探針見?,用TE溶液(pH8.0)稀釋至10pmol/L,,-20℃保存?zhèn)溆谩！鎯?nèi)參基因5'-FAM-TAGAGGAGCCTGTTCTATAATCG七5'CGCCCTCCAAATCAATAA-3’51FAM-ACGTGTTAAAGCATACATC-T5'-ATATCAACCACACGAGAGGS'-TTTAAACTGGAGAGTCGG5'FAM-AAACCAAGATATAGCTTAATT-TA11.3.2PCR反應(yīng)體系PremixExTagt(PerfectRealTime)(2×)12.5gL,10mmal/L引物，探針各0.75pL,ROXReferenceDyeⅡ(50×)0.5pL,DNA模板5pL,ddH?O4.75pL。11.3.3PCR反應(yīng)條件95℃,30s;95℃.5s,退火溫度(表2),35s,40個(gè)循環(huán)。11.3.4結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)設(shè)置無(wú)效基線范圍，基線范國(guó)選擇在3～15個(gè)循環(huán)，如果有強(qiáng)陽(yáng)性樣本，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整基線范圍。閾值設(shè)置原則以基線剛好超過正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，且Ct值=40為準(zhǔn)。設(shè)置閾值后，分析樣品的檢測(cè)結(jié)果。11.3.5結(jié)果判斷待測(cè)樣品山羊成分、綿羊成分檢測(cè)Ct值大于或等于40,內(nèi)參照基因檢測(cè)Cr位在20～30之間者，陰性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照和空自對(duì)照結(jié)果正常者，則可判定該樣品未檢出山羊成分，綿羊成分。待測(cè)樣品山羊成分、綿羊成分檢測(cè)Ct值小于或等于36,內(nèi)參照基因檢測(cè)Ct值在20～30之間者，陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照結(jié)果正常者，則可判定該樣品檢出山羊成分，綿羊成分。待測(cè)樣品山羊成分、綿羊成分檢測(cè)Ct值在36～40之間，應(yīng)重做實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。再次擴(kuò)增后的結(jié)果Ct值仍小于40者，且陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照結(jié)果正常，則可判定該樣品檢出山羊成分、綿羊成分；再次擴(kuò)增后結(jié)果Ct值大于40,且陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照結(jié)果正常，可判定該樣品未檢出山羊成分、綿羊成分。12防止污染的措施7(資料性附錄)試劑盒及試劑A.1組織和毛發(fā)提取試劑盒(與DNAIQ”系統(tǒng)結(jié)合使用)(推薦使用Promega公司產(chǎn)品)A.1.1組成(100次)溫育緩沖液(ineubntionbuffer)50mL蛋白酶K(proteinaseK)二硫疏糖醇(DTT)5.0g2×洗滌緩沖液(washbuffer)30mL裂解緩沖液(lysisbuffer)40mL.洗脫液(elutionbuffer)樹脂(resin)0.9mLA.1.2試劑配制A.1.2.1蛋白酶K儲(chǔ)存液向凍干的蛋白酶K瓶中加人5,5ml,溫育緩沖液，輕搖使之完全溶解。此蛋白酶K儲(chǔ)存液的終濃度為18mg/mL。將蛋白酶K儲(chǔ)存液分裝成小包裝，可在一20℃保存至1年，反復(fù)凍融不要超過5次。使用前將蛋白酶K放置在冰上融化及保存。將5gDTT溶于無(wú)核酸酶的水中至終體積為32.4mL,則DTT的終濃度為1mol/L,分裝成小包裝使用并保存在-20℃,A.1.2.31×洗滌緩沖液向2×洗滌緩沖液中加入15ml.95%～100%的乙醇和15mL異丙醇，混勻，室溫保存。A.1.2.4裂解液確定所需的裂解液的總量，每100pL.裂解緩沖液中加入1gl.1mol/LDTT,顛倒幾次混勻，室溫保存一個(gè)月。A.2PremirExTag””(PerfectRealTime)(2×)試劑盒組成PremirExTag"(PerfeetRealTime)(2X)1.0ROXReferenceDye(50×)在800mL水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na·2H?O),劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0,然后定容至1L.分裝后高壓滅菌。0.5mol/L.EDTA(pH8,0)(資料性附錄)B.1綿羊序列ATATCAACCACACGAGAGGAGACAAGTCGTAACAAGGTAAGCATACTGGAAAGCTTGGATAAACCAAGATATAGCTTAATTAAAGCATCTAGTTTACACCTAGAACACATTATGAGTATCTTGAACTATACCTAGCCCAAAATCTCCCACTCTCCB.2山羊序列CGCCCTCCAAATCAATAAGACT/CAAGAGGAGCAOG/TTCGT