關(guān)于呼吸系統(tǒng)疾病動物模型 呼吸系統(tǒng)疾病是一種常見病、多發(fā)病，主要病變在氣管、支氣管、肺部及胸腔，病變輕者多咳嗽、胸痛、呼吸受影響，重者呼吸困難、缺氧，甚至呼吸衰竭而致死。在城市的死亡率占第３位，而在農(nóng)村則占首位。更應(yīng)重視的是由于大氣污染、吸煙、人口老齡化及其他因素，使國內(nèi)外的慢性阻塞性肺?。ê喎Q慢阻肺，包括慢性支氣管炎、肺氣腫、肺心?。?、支氣管哮喘、肺癌、肺部彌散性間質(zhì)纖維化，以及肺部感染等疾病的發(fā)病率、死亡率有增無減。第2頁,共81頁，2024年2月25日，星期天咳嗽動物模型支氣管哮喘動物模型慢性支氣管炎模型肺氣腫和肺心病動物模型肺水腫動物模型肺纖維化動物模型肺結(jié)核病動物模型肺硅沉著癥動物模型第3頁,共81頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)

咳嗽動物模型

第4頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

咳嗽是呼吸系統(tǒng)多種疾病的常見癥狀。確定受試藥物的鎮(zhèn)咳作用,可采用小鼠氨水或二氧化硫引咳法及豚鼠枸櫞酸引咳法兩種模型加以確定,并與陽性藥物進(jìn)行同步觀察。

豚鼠是篩選鎮(zhèn)咳藥(antitussives)的常用動物。小鼠和大鼠給予化學(xué)刺激雖然能誘發(fā)咳嗽，但其咳嗽與噴嚏動作很難區(qū)別，變異較大，特別是反復(fù)刺激時變異更大，故小鼠主要作為初篩鎮(zhèn)咳藥時使用。第5頁,共81頁，2024年2月25日，星期天一、小鼠氨水引咳法

[造模原理]濃氨水是一種較強的化學(xué)刺激物，動物吸入氨水氣霧后，刺激呼吸道感受器，引起咳嗽。

[動物和主要器材]成年小鼠,性別不拘。500ml玻璃罩;空氣壓縮機(或腳踏風(fēng)箱)。

第6頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

[操作步驟]

1.小鼠置玻璃罩內(nèi)→空氣壓縮機以400mmHg恒壓將氨水噴入罩內(nèi)→噴霧5s→記錄動物咳嗽潛伏期和2min內(nèi)咳嗽次數(shù)。也可用引起一半小鼠咳嗽的噴霧時間(FDT50)為指標(biāo)。

2.觀察藥物的止咳作用小鼠按體重均分3組，每組至少15只小鼠。給藥組灌服受試藥，模型組灌服等體積生理鹽水，陽性對照藥組腹腔注射磷酸可待因30mg/kg體重。灌胃給予受試藥1h后、腹腔注射給予受試藥30min后開始噴霧。噴霧一定時間，終止噴霧，觀察咳嗽反應(yīng)。

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[模型評價與注意事項]1.氨水誘發(fā)小鼠咳嗽反應(yīng)變異性較大,可在初篩止咳藥時應(yīng)用。2.咳嗽潛伏期是指從噴入氨水開始至發(fā)生咳嗽所需的時間(秒數(shù))。小鼠咳嗽以腹肌收縮(縮胸)，同時張大嘴為準(zhǔn)，有時可有咳嗽聲，觀察必須仔細(xì)，也可用聽診器聽咳嗽聲。

3.避免腹腔注射給予受試藥,以免干擾動物的咳嗽反應(yīng)。

第8頁,共81頁，2024年2月25日，星期天二、小鼠二氧化硫引咳法

[造模原理]二氧化硫是一種強的化學(xué)刺激物質(zhì),動物吸入其氣霧后刺激呼吸道感受器,反射性引起咳嗽。無水亞硫酸鈉與硫酸反應(yīng)生成SO2。

第9頁,共81頁，2024年2月25日，星期天[操作步驟] 用一帶側(cè)口的三角燒瓶,側(cè)口通過橡皮管與球囊連接,燒瓶內(nèi)盛有無水亞硫酸鈉,燒瓶塞上裝一滴定管,內(nèi)灌硫酸，打開滴定管的活塞使硫酸滴到亞硫酸鈉上，在燒瓶內(nèi)產(chǎn)生SO2氣體，氣體儲存于球囊內(nèi)，用血管鉗夾緊，應(yīng)用時用注射器吸取4~10ml，注入放置實驗小鼠的廣口瓶內(nèi)。

第10頁,共81頁，2024年2月25日，星期天第11頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

3.觀察藥物的止咳作用小鼠按體重均分3組，給藥組灌胃給予受試藥，模型組灌胃給予等體積生理鹽水，陽性對照藥組腹腔注射磷酸可待因30mg/kg體重。灌胃給予受試藥1h或腹腔注射給藥30min后，將小鼠置于充滿SO2的燒杯內(nèi)，觀察咳嗽潛伏期，按下式計算藥物止咳率：

給藥組咳嗽潛伏期藥物止咳率（%）＝×100%

模型組咳嗽潛伏期第12頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

[注意事項]1.燒杯內(nèi)SO2的濃度要求在1:50000，該濃度足以引起咳嗽，如濃度過高(如1:10000)易造成動物中毒死亡。2.實驗中SO2產(chǎn)生的多少與實驗室溫度、無水亞硫酸鈉的量關(guān)系密切，故無水亞硫酸鈉的稱量應(yīng)準(zhǔn)確。

3.SO2引咳的個體差異較大,實驗時應(yīng)盡量減少各方面誤差。第13頁,共81頁，2024年2月25日，星期天三、豚鼠枸櫞酸引咳法

[造模原理]豚鼠吸入枸櫞酸溶液噴霧后，刺激呼吸道粘膜感受器，反射性引起咳嗽。

[動物和主要器材]體重200~250g豚鼠。2~4L玻璃罩;空氣壓縮機。第14頁,共81頁，2024年2月25日，星期天豚鼠體型短粗而圓，頭較大，眼大而圓還明亮，耳圓，上唇分裂，耳朵短??；四肢短，前腳具4趾，后腳3趾，無外尾。第15頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

[操作步驟]

1.將豚鼠置于玻璃干燥器內(nèi),用超聲霧化器噴入17.5%枸櫞酸霧化氣5~10s，觀察、記錄豚鼠咳嗽潛伏期或記錄5min內(nèi)豚鼠的咳嗽次數(shù)。

2.觀察藥物的止咳作用將豚鼠按體重隨機分為3組,給藥組灌胃給予受試藥,模型組灌胃給予等體積生理鹽水,陽性對照藥組腹腔注射磷酸可待因5mg/kg體重。灌胃給予受試藥1h或腹腔注射給藥30min后，按上述方法引咳,評受試藥的止咳效果。

第16頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

[模型評價與注意事項]1.豚鼠對化學(xué)性刺激物很敏感,刺激后能誘發(fā)咳嗽,動物容易得到。二氧化硫引咳法、氨水引咳法和枸櫞酸引咳法是研究止咳藥的三種常用方法，前二者系用小鼠，費用較低廉，適合于研究止咳藥效果的初篩，確定效果后，再用豚鼠作進(jìn)一步研究。

2.豚鼠的咳嗽聲響亮，應(yīng)以能聽到聲音為咳嗽。3.實驗前1日豚鼠應(yīng)預(yù)先挑選，噴霧后5min內(nèi)咳嗽次數(shù)少于10次者應(yīng)予以淘汰。第17頁,共81頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)

支氣管哮喘動物模型

支氣管哮喘(bronchialasthma)簡稱哮喘，是氣道的一種慢性變態(tài)反應(yīng)性炎癥性疾病。哮喘是由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥，由此導(dǎo)致患者的氣道高反應(yīng)性（氣道對各種刺激因素出現(xiàn)過強或過早的收縮反應(yīng)），造成氣道縮窄，氣流受阻。

第18頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

臨床上表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作性喘息、呼氣性呼吸困難和胸悶等癥狀。哮喘是一種常見疾病，全球約有1億5千萬，我國約有1千5百萬哮喘病人，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一。

哮喘的發(fā)病機制尚不完全清楚，有許多因素參與。過去認(rèn)為哮喘是IgE介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)性疾病，目前認(rèn)識到哮喘是以氣道高反應(yīng)性為主要特征的慢性氣道炎癥性疾病。哮喘發(fā)病分為速發(fā)相和遲發(fā)相兩個階段。第19頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

速發(fā)相階段:肥大細(xì)胞是主要效應(yīng)細(xì)胞，致敏抗原與肥大細(xì)胞表面IgE抗體結(jié)合。當(dāng)相同抗原再次進(jìn)入機體后，引發(fā)肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺、5-羥色胺等炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致支氣管痙攣、氣管粘膜微血管通透性增加、氣管粘膜水腫和粘液分泌亢進(jìn)。

遲發(fā)相反應(yīng):特征是大量嗜酸性粒細(xì)胞局部浸潤。

第20頁,共81頁，2024年2月25日，星期天一、過敏性哮喘模型

[造模原理]過敏性哮喘(allergicasthma)的發(fā)病機制涉及引起過敏的抗原?？乖话憔邆鋬煞N特性：

一是免疫原性，即能刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，包括特異性抗體和致敏T細(xì)胞；

二是抗原性，系指能與抗體或致敏T細(xì)胞在體內(nèi)外發(fā)生特異性結(jié)合。第21頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

過敏性哮喘模型的復(fù)制需要致敏和激發(fā)兩個步驟。動物以卵清蛋白(ovalbumin，卵白蛋白)為致敏的抗原(有時并用免疫佐劑如氫氧化鋁、滅活百日咳桿菌菌苗等)，經(jīng)腹腔或皮下注射，刺激機體產(chǎn)生IgE，并結(jié)合在肥大細(xì)胞等細(xì)胞表面，使機體處于致敏狀態(tài)。

一定時間后當(dāng)動物再次接觸到相同抗原后，發(fā)生I型速發(fā)型過敏反應(yīng)，呼吸道粘膜肥大細(xì)胞等合成并釋放多種生物活性物質(zhì)，引起支氣管平滑肌收縮、粘液分泌增多、血管通透性增高和炎癥細(xì)胞浸潤等(激發(fā))，導(dǎo)致哮喘發(fā)作。第22頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

(一)腹腔注射致敏劑豚鼠模型[動物、試劑與器材]體重250~300g豚鼠，雌雄不限。10%和0.5%~1%卵清蛋白生理鹽水溶液；超聲霧化器。

[操作方法]

1.致敏腹腔注射10%卵清蛋白生理鹽水溶液1.0ml（含卵清蛋白100mg）使豚鼠處于致敏狀態(tài)。

2.激發(fā)注射卵清蛋白后2周，將豚鼠置于密閉有機玻璃箱內(nèi)，用0.5%~1%卵清蛋白生理鹽水溶液超聲霧化吸入30s~2min，誘發(fā)豚鼠哮喘發(fā)作。3.支氣管-肺泡灌洗。

第23頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

[結(jié)果及模型評價]1.豚鼠可出現(xiàn)氣喘表現(xiàn)，咳嗽、煩躁、口唇和四肢紫紺，呼吸費力掙扎，呼吸頻率加快和呼吸加深。病理檢查可發(fā)現(xiàn)肺毛細(xì)血管擴(kuò)張、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和腺體分泌亢進(jìn)。2.豚鼠是能最好顯示氣道高反應(yīng)性的動物，其哮喘發(fā)作與人類的表現(xiàn)相似。

3.用于復(fù)制過敏性哮喘動物模型的抗原物質(zhì)主要有卵清蛋白、蛔蟲卵、塵螨、豚草花粉、真菌孢子、蟑螂等。卵清蛋白為蛋清提取物，免疫原性強，來源方便，價格低廉，最常用于復(fù)制哮喘模型。第24頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

4.卵清蛋白激發(fā)豚鼠哮喘發(fā)作是目前國內(nèi)外常用的方法，操作簡單，可重復(fù)性強。本模型主要用于哮喘發(fā)病機制研究和治療效果觀察。動物每日引喘1次，反復(fù)10~14d，可成為哮喘慢性發(fā)作模型。

5.本模型最大的缺點是豚鼠對卵清蛋白反應(yīng)的個體差異很大，少數(shù)豚鼠可能不出現(xiàn)哮喘反應(yīng)，而一些動物則可發(fā)生急性過敏性休克。第25頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

[注意事項]1.宜選用等級高、溶解性好的卵清蛋白。2.超聲霧化器應(yīng)氣霧流量較大、霧化顆粒較小。3.激發(fā)用的抗原量和吸入時間非常重要，霧化吸入的卵清蛋白溶液必須用較低濃度，以減少動物死亡。

4.動物一旦出現(xiàn)腹肌明顯收縮，應(yīng)立即將其移出有機玻璃箱，以免因窒息而死亡。

第26頁,共81頁，2024年2月25日，星期天二、哮喘離體實驗方法

(一)豚鼠氣管片法

[基本原理]將制備的氣管片置于盛有營養(yǎng)液的恒溫浴槽內(nèi),加一定負(fù)荷,通過拉力換能器,將致痙劑或受試藥對氣管作用所產(chǎn)生的張力轉(zhuǎn)換為電信號,放大后由記錄儀描記出標(biāo)本的舒縮曲線,可反映大氣道的舒縮變化。第27頁,共81頁，2024年2月25日，星期天?取出氣管,制備氣管片

第28頁,共81頁，2024年2月25日，星期天?制備氣管螺旋條第29頁,共81頁，2024年2月25日，星期天?連接到描記裝置供氧的離體器官浴槽內(nèi)第30頁,共81頁，2024年2月25日，星期天?觀察藥物作用

加組胺或乙酰膽堿——氣管條張力達(dá)到最高點時,分別加入不同劑量受試藥,記錄氣管條張力變化.求受試藥的解痙百分率

給藥前曲線高度－給藥后曲線高度解痙百分率（%）＝×100

給藥前曲線高度第31頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

第三節(jié)慢性支氣管炎模型第32頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

慢性支氣管炎(chronicbronchitis,簡稱慢支)是指氣管、支氣管粘膜及其周圍組織的慢性非特異性炎癥。臨床上以反復(fù)發(fā)作咳嗽、咳痰或伴有喘息癥狀為特征,且癥狀每年至少持續(xù)3個月,連續(xù)兩年以上。病情持續(xù)多年者常并發(fā)肺氣腫和慢性肺心病。

慢支的病因和發(fā)病機制較復(fù)雜，是由多種因素長期綜合作用所致。已確定的致病因素包括細(xì)菌和病毒感染、吸煙、空氣污染、過敏和機體內(nèi)在因素等。第33頁,共81頁，2024年2月25日，星期天一、大鼠煙熏模型

[造模原理]煙霧中含有許多有害物質(zhì),如焦油、CO、尼古丁及氧化物等,它們隨煙霧被吸入支氣管,抑制粘膜上皮細(xì)胞的纖毛運動,刺激分泌增加,降低巨噬細(xì)胞的吞噬功能而有利于感染。隨著煙霧刺激時間的延長,氣管炎癥逐漸加重,一般在21d后開始出現(xiàn)呼吸道慢性炎癥,約至第7周可形成慢性支氣管炎的典型病理變化。

第34頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

[操作方法]成年雄性大鼠。將大鼠置于27m3煙室內(nèi),吸入混合煙150~200mg/m3(200g鋸末,15~20g煙葉,6~7g干辣椒及1g硫磺混合,20~30min內(nèi)燒化,顆粒在0.5~1μm以上)，每周吸入6次,44d后即可形成慢性支氣管炎病變。

第35頁,共81頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)肺氣腫和肺心病動物模型第36頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

阻塞性肺氣腫(簡稱肺氣腫)是呼吸性細(xì)支氣管、肺泡管、肺泡囊和肺泡因過度充氣呈持久性擴(kuò)張，并伴有肺泡間隔破壞，肺組織彈性減弱，導(dǎo)致肺體積膨大、功能降低的病理狀態(tài)。肺氣腫常繼發(fā)于其他肺阻塞性疾病，尤以慢性支氣管炎最為常見。

肺氣腫發(fā)病機制與慢性支氣管炎引起的呼吸道阻塞(特別是小氣管)、體內(nèi)α１-抗胰蛋白酶或α２-巨球蛋白缺乏、遺傳因素、變態(tài)反應(yīng)等有關(guān)。目前復(fù)制肺氣腫動物模型的主要方法有利用彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶、氯化鎘、饑餓、吸煙誘發(fā)肺氣腫和轉(zhuǎn)基因肺氣腫模型等。

第37頁,共81頁，2024年2月25日，星期天第38頁,共81頁，2024年2月25日，星期天第39頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

肺源性心臟病(corpulmonale，簡稱肺心病)是呼吸系統(tǒng)的常見病，是指由支氣管-肺組織、胸廓或肺動脈病變引起肺血管阻力增加，產(chǎn)生肺動脈高壓等多種因素的心臟病。根據(jù)起病的緩急和病程長短，可分為急性和慢性兩種，以后者為多見。第40頁,共81頁，2024年2月25日，星期天一、彈性蛋白酶誘發(fā)兔肺氣腫模型

[造模原理]

肺組織中參與肺泡壁降解的蛋白酶主要是彈性蛋白酶(elastase)。彈性蛋白酶和彈性蛋白酶抑制因子(主要為α１-抗胰蛋白酶)失平衡可能在肺氣腫發(fā)生中起一定作用。

第41頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

在正常情況下,彈性蛋白酶抑制因子可以抑制此酶的活性,使彈性蛋白酶與彈性蛋白酶抑制因子之間處于平衡狀態(tài),維持肺組織正常結(jié)構(gòu),避免肺氣腫的發(fā)生,但當(dāng)彈性蛋白酶活性過強時可造成肺氣腫。

本模型主要基于肺氣腫形成的彈性蛋白酶和彈性蛋白酶抑制因子之間的失平衡學(xué)說。彈性蛋白酶注入肺內(nèi)后,穿越肺泡上皮細(xì)胞進(jìn)入肺間質(zhì),降解彈性纖維,從而形成肺氣腫。第42頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

[操作方法]

體重2.5~3.0kg雄性新西蘭白兔。

1.家兔用氯胺酮麻醉后,仰臥位固定在操作臺上,將內(nèi)徑3.0mm的氣管插管插入家兔氣管內(nèi)。

2.經(jīng)氣管插管緩慢注入胰彈性蛋白酶2000U/kg體重3ml。將兔直立旋轉(zhuǎn)，使藥液均勻分布于兩肺內(nèi)。

3.氣管內(nèi)注入胰彈性蛋白酶后2、4和6周分別處死動物，切取肺組織,在10%中性緩沖甲醛液中固定后,常規(guī)制備石蠟切片,觀察肺病變。

4.用圖像分析儀進(jìn)行形態(tài)定量分析每只動物觀察2張切片,每張切片隨機觀察測量8個視野。測量平均肺泡面積、單位面積肺泡數(shù)和平均內(nèi)襯間隔。

第43頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

[結(jié)果]

注入胰彈性蛋白酶后2周，肺組織充血、水腫,各級支氣管、血管周圍、肺間質(zhì)內(nèi)有大量中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤。

4周時上述改變進(jìn)一步加重，部分肺泡腔明顯擴(kuò)大。

6周時，呼吸性細(xì)支氣管、肺泡管、肺泡囊及肺泡擴(kuò)大，肺泡壁變薄、斷裂，有的已融合成肺大泡，形成中度肺氣腫。

第44頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

[注意事項]1.在彈性蛋白酶誘發(fā)肺氣腫模型時,目前應(yīng)用較多的彈性蛋白酶為豬胰彈性蛋白酶，也可使用從人中性粒細(xì)胞中提取的彈性蛋白酶,前者作用較強。

2.可有多種給藥途徑給彈性蛋白酶，如霧化吸入、氣管穿刺滴入、氣管插管滴入和靜脈注射等。第45頁,共81頁，2024年2月25日，星期天二、野百合堿誘發(fā)大鼠肺心病模型

[造模原理]

野百合堿能損傷肺小動脈內(nèi)皮細(xì)胞,引起動脈壁增厚,管腔縮小,血管阻力增加,使右心負(fù)荷加重,導(dǎo)致肺心病。

第46頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

[主要試劑]

用純乙醇與生理鹽水(體積比2:8)混合液配制2%野百合堿水溶液。

[操作方法]

雄性成年大鼠。對照組大鼠腹腔注射等體積純乙醇與生理鹽水(體積比2:8)混合液，模型組大鼠一次性腹腔注射2%野百合堿水溶液60mg/kg體重。第47頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

[結(jié)果]

對照組大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞扁平、連續(xù)、分布均勻，大小、薄厚較一致。注射野百合堿后13d即可出現(xiàn)肺心病?？梢姺窝苊黠@損傷,內(nèi)皮細(xì)胞變性腫脹,突向管腔,甚至壞死脫落。肺內(nèi)肌型動脈中膜比例增大,血管壁增厚,管腔變窄,有的可完全閉塞,可見血管周圍炎。另外右心肥大指數(shù)增加。

第48頁,共81頁，2024年2月25日，星期天第五節(jié)肺水腫動物模型第49頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

肺水腫(pulmonaryedema)是指液體在肺泡間質(zhì)和(或)肺泡內(nèi)過多聚積所致的綜合征。肺水腫是常見的危重急癥,可由多種原因引起,大多數(shù)是由于肺毛細(xì)血管壁通透性增加和(或)毛細(xì)血管內(nèi)流體靜壓升高所致。

第50頁,共81頁，2024年2月25日，星期天一、油酸誘發(fā)大鼠肺水腫模型

[造模原理]

可能是由于油酸進(jìn)入機體后，激活補體，產(chǎn)生C5a,后者趨化炎細(xì)胞聚集在肺內(nèi),釋放自由基,損傷肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞,使之通透性增加,引起肺水腫。

第51頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

[操作方法]

體重250g的SD或Wistar大鼠,性別不限。通過靜脈緩慢注射油酸0.1ml/kg體重，注射油酸后不同時間處死動物,稱體重,開胸，結(jié)扎氣管后取出心肺，分離心臟,稱肺重，測量肺系數(shù)。

第52頁,共81頁，2024年2月25日，星期天二、腎上腺素誘發(fā)家兔肺水腫模型

[操作方法]

家兔2.5~3kg。家兔耳緣靜脈緩慢注射0.1%腎上腺素1.0ml/kg體重。

解剖可見肺臟明顯腫大、膨隆、淤血、出血,切面有粉紅色泡沫樣液體溢出。肺濕重和肺系數(shù)可增至正常對照的2~3倍或以上。間質(zhì)和肺泡內(nèi)充滿富含蛋白的水腫液,肺不張,萎陷,出血。

第53頁,共81頁，2024年2月25日，星期天第六節(jié)肺纖維化動物模型第54頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

肺纖維化（pulmonaryfibrosis）是多種原因引起慢性肺疾病的共同結(jié)局，是呼吸衰竭的主要病理基礎(chǔ)，其病理改變過程是肺部炎癥導(dǎo)致肺泡持續(xù)性損傷，經(jīng)反復(fù)破壞、修復(fù)、重建，最后引起細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積。第55頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

[造模原理]

博萊霉素(bleomycin)致肺纖維化的機制迄今未明，可能與自由基損傷、免疫機制和膠原調(diào)節(jié)失調(diào)等有關(guān),其中自由基損傷可能是主要機制,活性氧造成急性肺泡炎,進(jìn)而發(fā)展為肺纖維化。

第56頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

[實驗動物]

體重200g左右的SD或Wistar大鼠。

[主要試劑]

博萊霉素,用生理鹽水配成4mg/ml溶液.立式照明燈或額戴式喉鏡；斜端聚乙烯塑料管(作為氣管插管用)。

第57頁,共81頁，2024年2月25日，星期天[操作步驟]1.乙醚麻醉后,仰位以上門齒為懸掛點使大鼠斜掛在60°鼠臺上,頸前放置照明燈第58頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

2.墊小塊紗布將鼠舌拉出,用壓舌板壓住舌腹,趁動物吸氣瞬間迅速將平端聚乙烯塑料管(連1ml注射器,內(nèi)盛博萊霉素NS溶液)通過聲帶開口插入氣管4~5cm,用棉絮試驗導(dǎo)管是否進(jìn)入氣管,確定后緩慢注入博萊霉素溶液,劑量為5mg/kg(0.25ml/只)。

3.注入藥物后將動物直立搓動旋轉(zhuǎn),盡量使藥液在肺內(nèi)分布均勻。

4.注入藥液后3、7、14和28d處死動物,收集肺標(biāo)本,部分用于檢測肺羥脯氨酸含量等,部分用中性福爾馬林固定,常規(guī)石蠟切片,HE(蘇木精-伊紅)和結(jié)締組織染色。第59頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

[結(jié)果]

注入藥液后3d和7d表現(xiàn)為肺明顯急性炎癥,肺間隔水腫,炎癥細(xì)胞浸潤,以嗜中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞為主,伴有輕度出血。

14d肺臟系數(shù)(肺重/體重)增加,肺泡壁肺泡巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞明顯減少,成纖維細(xì)胞增多,肺泡隔明顯增寬,有膠原沉積,呈斑片狀纖維化改變。

28d時肺組織結(jié)構(gòu)破壞,肺泡腔明顯縮小,部分肺泡塌陷或消失,肺間質(zhì)出現(xiàn)大量膠原纖維和成纖維細(xì)胞,形成彌漫性肺纖維化。第60頁,共81頁，2024年2月25日，星期天[模型評價]

1.博萊霉素是多肽類抗腫瘤藥物,單次氣管內(nèi)注入可復(fù)制出與人類肺纖維化相似的動物模型,具有操作簡便、造模穩(wěn)定的優(yōu)點,是目前最常用的肺纖維化動物模型。

2.適當(dāng)掌握麻醉深度,氣管插管操作應(yīng)熟練,否則可能造成咽喉、聲帶損傷。

3.除前述的氣管插管外,也可在麻醉下,切開頸前皮膚分離氣管,用4號針頭在氣管環(huán)狀軟骨之間刺入氣管內(nèi)注藥,這在小鼠較為常用.也可采用經(jīng)鼻吸入的方法.第61頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

4.用博萊霉素也能在倉鼠、小鼠等動物誘發(fā)肺纖維化,基本方法與大鼠模型相同.小鼠博萊霉素的用量同大鼠,但也可用2.5mg/kg體重.

5.也可用6~8周齡雄性ICR小鼠，經(jīng)鼻滴入博萊霉素3mg/kg體重，可制備與氣管內(nèi)直接給藥同樣的肺纖維化模型，給藥2周時出現(xiàn)明顯肺纖維化。此方法對動物損傷小，死亡率低。第62頁,共81頁，2024年2月25日，星期天第七節(jié)肺結(jié)核病動物模型第63頁,共81頁，2024年2月25日，星期天目前，全球結(jié)核病(tuberculosis)疫情呈明顯上升趨勢。在全球所有傳染病中,結(jié)核病已成為成年人的首要死因。在我國結(jié)核病流行形勢也十分嚴(yán)峻，防治任務(wù)艱巨。

第64頁,共81頁，2024年2月25日，星期天結(jié)核結(jié)節(jié)第65頁,共81頁，2024年2月25日，星期天一、小鼠模型

[實驗動物]體重16~20g小鼠,雌雄各半,同批實驗體重差別不超過2g。[操作步驟]1.臨用前,取在改良的羅氏培養(yǎng)基生長2周的強毒人型結(jié)核桿菌(H37RV)的表面膜狀物,稱重,研磨后用NS配制含1~5mg/ml(濕重)的菌液。

第66頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

2.給小鼠尾靜脈注射上述菌液0.2ml/只,12~29d后可死亡,于感染后第3d開始給予試驗藥。

3.半數(shù)死亡時間(T50)一般在14~16d.通常在靜脈注射3周后若對照組大部分動物死亡,即可終止實驗,剖檢臟器。

4.觀察動物死亡時間或T50,動物生存率,肉眼觀察病死和處死動物的肺臟病變面積并分級,測定肺、肝、脾臟的臟器指數(shù),進(jìn)行臟器的結(jié)核桿菌培養(yǎng)。第67頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

[模型評價]

1.靜脈接種所致急性肺結(jié)核是一個適合于藥物篩選的模型,不僅對已知藥物的反應(yīng)和臨床療效一致,而且也與其它動物的實驗結(jié)果一致。

2.方法簡便,試驗時間較短,用藥量少,工作量小。

3.與大動物相比,小鼠更容易達(dá)到統(tǒng)計學(xué)要求的動物數(shù)。第68頁,共81頁，2024年2月25日，星期天[注意事項]1.感染前需先檢測菌株毒力,以每只小鼠尾靜脈感染1mg菌的T50小于2周為宜。2.動物體重、年齡影響實驗結(jié)果,同一次實驗中體重應(yīng)接近或基本一致。

3.本實驗屬于感染性動物實驗,可能危害實驗人員,應(yīng)按照P實驗室的操作規(guī)范進(jìn)行操作。

(P實驗室:

根據(jù)病原微生物的分類級別而設(shè)置的實驗室)第69頁,共81頁，2024年2月25日，星期天第八節(jié)肺硅沉著癥動物模型第70頁,共81頁，2024年2月25日，星期天

肺