從臨床進(jìn)入基因檢測(cè)步驟是入口，檢測(cè)結(jié)果結(jié)合臨床信息進(jìn)行合了解讀是出口，這一入一出之間需經(jīng)歷檢測(cè)前臨床咨詢部分、試驗(yàn)室部分、信息分析部分、臨床解讀部分共四個(gè)步驟。其中第四部分臨床解讀部分即是依據(jù)檢測(cè)結(jié)果、患者信息、醫(yī)生共識(shí)綜合判定，臨床和遺傳咨詢有效銜接、充足溝通，最終出具臨床解讀匯報(bào)。在做成臨床解讀匯報(bào)之前，首先需要將解讀各個(gè)步驟進(jìn)行明確，包含解讀步驟步驟，解讀技術(shù)細(xì)節(jié)。這么才有可能真正做到解讀規(guī)范化，使解讀過程有據(jù)可依，有章可循，才能出具一份好臨床解讀匯報(bào)，基因檢測(cè)才能愈加好服務(wù)患者和臨床醫(yī)生。從大框架講，基因檢測(cè)數(shù)據(jù)解讀可分為三個(gè)步驟：原始數(shù)據(jù)→分析數(shù)據(jù)、基于數(shù)據(jù)庫解讀→和患者個(gè)體表征/臨床病例結(jié)合解讀。1、讀懂原始數(shù)據(jù)將測(cè)序原始序列數(shù)據(jù)（FASTQ）去除接頭及低質(zhì)量序列，經(jīng)BWA軟件比對(duì)至GRCh37/38（NCBI版本）或hg19/hg38（UCSC版本）人類基因組參考序列上，Picard去除反復(fù)序列，使用GATK檢測(cè)SNV和Indel變異，使用ANNOVAR進(jìn)行變異注釋。最終取得一份.vcf文件（圖1）。圖1從測(cè)序原始序列數(shù)據(jù)到vcf文件步驟一份vcf文件包含以下基礎(chǔ)信息。Chr：變異所在染色體Start：變異在染色體上起始位置End：變異在染色體上結(jié)束位置Ref：參考基因組序列Alt：檢測(cè)樣本基因組序列Func.refGene：變異所處參考基因功效區(qū)（exonic，intronic，UTR3，UTR5，splicing，upstream，downstream，intergenic）（此處exonic特指外顯子編碼氨基酸區(qū)，不包含外顯子UTR區(qū)）Gene.refGene：變異所處參考基因名稱（假如是基因間，則是兩側(cè)基因）GeneDetail.refGene：非外顯子區(qū)處于特定轉(zhuǎn)錄本中具體位置（假如是基因間，則是距離兩側(cè)基因距離）ExonicFunc.refGene：外顯子區(qū)變異類型（frameshiftinsertion，frameshiftdeletion，stopgain，stoploss，nonframeshiftinsertion，nonframeshiftdeletion，synonymousSNV，nonsynonymousSNV），假如這一欄是一個(gè)“.”話，就說明該變異不在外顯子區(qū)AAChange.refGene：氨基酸水平改變（同一個(gè)基因可能含有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，氨基酸改變位置在不一樣轉(zhuǎn)錄本中有可能不一樣）經(jīng)注釋后vcf文件還會(huì)包含以下信息：CLINSIG：該變異在ClinVar數(shù)據(jù)庫中臨床意義（Benign，Likelybenign，Uncertainsignificance，Likelypathogenic，Pathogenic，Drug-response）CLINDBN：該變異所引發(fā)疾病名稱CLINACC：該變異登記號(hào)和版本號(hào)（VariantAccessionandVersions）CLINSDB：該變異所引發(fā)疾病所在數(shù)據(jù)庫名稱CLINSDB：該變異所引發(fā)疾病所在數(shù)據(jù)庫中IDPopFreqMax：該變異人群中最大等位基因頻率1000_All：該變異在千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫中人群等位基因頻率1000_AFR：該變異在千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫中非洲人群等位基因頻率1000_AMR：該變異在千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫中美國人群等位基因頻率1000_EAS：該變異在千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫中東亞人群等位基因頻率1000_EUR：該變異在千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫中歐洲人群等位基因頻率1000_SAS：該變異在千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫中南亞人群等位基因頻率Snp138：該變異在dbSNP數(shù)據(jù)庫中IDCosmic70：該變異在癌癥體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)庫COSMIC中IDESP6500siv2_ALL：該變異在美國國家心肺血液研究所ESP6500數(shù)據(jù)庫中人群等位基因頻率ESP6500siv2_AA：該變異在美國國家心肺血液研究所ESP6500數(shù)據(jù)庫中非洲裔人群等位基因頻率ESP6500siv2_EA：該變異在美國國家心肺血液研究所ESP6500數(shù)據(jù)庫中歐洲裔人群等位基因頻率ExAC_All：該變異在ExAC數(shù)據(jù)庫中人群等位基因頻率ExAC_AFR：該變異在ExAC數(shù)據(jù)庫中非洲人群等位基因頻率ExAC_AMR：該變異在ExAC數(shù)據(jù)庫中美國人群等位基因頻率ExAC_EAS：該變異在ExAC數(shù)據(jù)庫中東亞人群等位基因頻率ExAC_FIN：該變異在ExAC數(shù)據(jù)庫中芬蘭人群等位基因頻率ExAC_NFE：該變異在ExAC數(shù)據(jù)庫中非芬蘭歐洲人群等位基因頻率ExAC_OTH：該變異在ExAC數(shù)據(jù)庫中除已指定人群之外人群等位基因頻率ExAC_SAS：該變異在ExAC數(shù)據(jù)庫中南亞人群等位基因頻率CG46：該變異在CG46數(shù)據(jù)庫中人群等位基因頻率。CG46是由CompleteGenomics（BGI）企業(yè)對(duì)46個(gè)樣本全基因組測(cè)序而建立數(shù)據(jù)庫，截止，她們已經(jīng)對(duì)超出0個(gè)樣本進(jìn)行了全基因組測(cè)序和分析。ICGC_Id：國際癌癥基因協(xié)作組中各研究IDICGC_Occurrence：該變異在ICGC數(shù)據(jù)庫中發(fā)生情況。該欄數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)如COCA-CN|1|187|0.00535，指中國結(jié)直腸癌研究（），在187例患者中有1例發(fā)生突變，突變百分比為0.00535Nci60：該變異在nci60數(shù)據(jù)庫中等位基因頻率。Nci60是被廣泛用于藥品篩選人類60種腫瘤細(xì)胞系組合，已經(jīng)進(jìn)行了全外測(cè)序。伴隨研究進(jìn)步，美國癌癥研究所NCI在宣告NCI-60細(xì)胞系“退休”，PDX新模型“上任”。Interpro_domain：InterPro算法估計(jì)突變所處保守結(jié)構(gòu)域（）dbscSNV_ADA_SCORE：基于adaptiveboosting估計(jì)變異對(duì)剪接位點(diǎn)改變可能性dbscSNV_RF_SCORE：基于RandomForest估計(jì)變異對(duì)剪接位點(diǎn)改變可能性。得分代表剪接影響可能性大小，假如dbscSNV_ADA_SCORE和dbscSNV_RF_SCORE得分均小于0.6，則對(duì)剪接位點(diǎn)沒有影響（PMID:28132688）。Omim_phenotype：在OMIM數(shù)據(jù)庫中該基因（不是該變異）對(duì)應(yīng)表型QUAL：測(cè)序質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算方法為Q=-10log10(e)，可衡量堿基未正確檢出概率。FILTER：對(duì)變異位點(diǎn)做深入過濾。不管你用什么方法對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行過濾，過濾完了以后，在FILTER一欄全部會(huì)留下過濾統(tǒng)計(jì)，假如是經(jīng)過了過濾標(biāo)準(zhǔn)，那么這些經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)好變異位點(diǎn)FILTER一欄就會(huì)注釋一個(gè)PASS，假如沒有經(jīng)過過濾，就會(huì)在FILTER這一欄提醒除了PASS其它信息（otherFILTERflag）。假如這一欄是一個(gè)“.”話，就說明沒有進(jìn)行過任何過濾INFO&FORMAT：該欄數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)GT:AD:AF:ALT_F1R2:ALT_F2R1:FOXOG:QSS:REF_F1R2:REF_F2R1。GT：基因型，對(duì)于一個(gè)二倍體生物，0表示跟REF一樣，1表示表示跟Alt一樣；2表示第二個(gè)Alt；AD：對(duì)應(yīng)兩個(gè)以逗號(hào)隔開值，這兩個(gè)值分別表示覆蓋到REF和Alt堿基reads數(shù)，相當(dāng)于支持REF和支持Alt測(cè)序深度；AF：支持Alt測(cè)序深度占總測(cè)序深度百分比，即等位基因豐度NORMAL：和腫瘤組織對(duì)應(yīng)正常組織中信息，通常經(jīng)過外周血測(cè)序取得TUMOR：腫瘤組織中信息另外還可能包含多種算法對(duì)非同義突變保守性估計(jì)值，這些算法包含SIFTprediction(T:tolerated;D:deleterious)，PolyPhenHumanDivprediction(D:Probablydamaging,P:possiblydamaging;B:benign)、LTR、MutTaster、MutationAssessor、FATHMM、CADD、GERP++等等。2、分析挖掘數(shù)據(jù)對(duì)全外顯子檢測(cè)（或?qū)儆谳^大pannel范圍情況也能夠），能夠進(jìn)行腫瘤突變負(fù)荷（Tumormutationburden）計(jì)算。臨床研究表明，使用PD1/PD-L1抑制劑等免疫診療藥品時(shí)，含有較高突變負(fù)荷患者含有很好客觀緩解率(ORR)、較長無進(jìn)展生存期(PFS)，同時(shí)連續(xù)臨床療效(DCB)也更佳。然而，因?yàn)楝F(xiàn)在沒有統(tǒng)一腫瘤突變負(fù)荷計(jì)算方法，在做縱向比較時(shí)需謹(jǐn)慎。該分析使用計(jì)算方法為，腫瘤組織中突變豐度大于等于5%，正常組織中突變豐度小于等于1%，ExonicFunc.refGene一欄去除“.”、synonymousSNV、unknown標(biāo)簽數(shù)據(jù)，PopFreqMax一欄去除人群等位基因頻率大于0.1%數(shù)據(jù)（注意保留“.”）。另外，免疫診療相關(guān)部分基因突變（如EGFR、干擾素信號(hào)通路JAK、B2M等）值得關(guān)注。對(duì)全外顯子檢測(cè)，能夠發(fā)覺大量體細(xì)胞突變。有突變是致病性稱為為驅(qū)動(dòng)突變或司機(jī)突變（和之對(duì)應(yīng)稱為乘客突變或繼發(fā)性突變），這些突變或造成DNA修復(fù)缺點(diǎn)，或造成細(xì)胞不受調(diào)控增殖生長，或造成細(xì)胞不能正常凋亡，或造成細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)，或造成免疫逃逸。所以從大量體細(xì)胞突變中判定腫瘤驅(qū)動(dòng)基因突變既是基因檢測(cè)關(guān)鍵目標(biāo)之一，同時(shí)也是一項(xiàng)艱苦工作。通常來說一個(gè)腫瘤發(fā)生其驅(qū)動(dòng)基因突變數(shù)目為0-8個(gè)，且她們不會(huì)分布于同一個(gè)關(guān)鍵腫瘤相關(guān)信號(hào)通路中（比如BRAF和KRAS，比如APC和CTNNB1）或并行兩個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路中（比如PIK3CA和KRAS）。通常來說原癌含有較為顯著突變熱點(diǎn)聚集傾向（比如KRAS和PIK3CA），而抑癌基因突變位點(diǎn)較為分散（比如RB1和VHL）。對(duì)全外顯子檢測(cè)現(xiàn)在已經(jīng)在腫瘤中得到較為廣泛應(yīng)用，怎樣高效尋求驅(qū)動(dòng)基因突變急需指導(dǎo)和規(guī)范化文件，但因?yàn)槟[瘤細(xì)胞突變多為體細(xì)胞突變，遺傳性突變領(lǐng)域規(guī)范化文件（后面會(huì)具體講）難以照搬使用。因?yàn)轶w細(xì)胞突變意義和遺傳性突變意義比如致病性突變這么描述有所不一樣，比如我們能夠采取響應(yīng)藥品突變（responsive）、耐藥突變（resistant）、驅(qū)動(dòng)性突變（driver）、繼發(fā)性突變（passenger）來描述突變意義。值得慶幸是，伊始，分子病理協(xié)會(huì)（AssociationforMolecularPathology,AMP）、美國臨床腫瘤協(xié)會(huì)（AmericanSocietyofClinicalOncology）和美國病理學(xué)家聯(lián)盟（CollegeofAmericanPathologists）對(duì)高通量測(cè)序在腫瘤診療領(lǐng)域應(yīng)用從突變記載（HGVS）、注釋解讀、匯報(bào)進(jìn)行了指導(dǎo)和規(guī)范（PMID:27993330）。該指導(dǎo)規(guī)范中對(duì)參考序列數(shù)據(jù)庫（如NCBI）、人群基因頻率數(shù)據(jù)庫（如1000G、ExAC）、腫瘤數(shù)據(jù)庫（如COSMIC、ICGC）、疾病數(shù)據(jù)庫（如HGMD、ClinVar）、估計(jì)軟件（如PolyPhen2、HumanSplicingFinder）使用和注意事項(xiàng)給出了意見。該規(guī)范還推薦對(duì)腫瘤細(xì)胞體細(xì)胞變異劃分為四個(gè)等級(jí)：含有確定性臨床意義突變（variantswithstrongclinicalsignificance，LevelA和LevelB）、可能含有臨床意義突變（variantswithpotentialclinicalsignificance，LevelC和LevelD）、臨床意義不明突變（variantsofunknownclinicalsignificance）、良性或可能良性突變（variantsdeemedbenignorlikelybenign），并具體敘述怎樣將檢測(cè)到突變結(jié)合數(shù)據(jù)庫以歸類到這四個(gè)等級(jí)中。其中含有確定性臨床意義/可能含有臨床意義突變包含四個(gè)等級(jí)證據(jù)：LevelA：可作為估計(jì)藥品反應(yīng)或耐藥性FDA同意針對(duì)特定類型腫瘤（適應(yīng)癥）診療突變；或已經(jīng)被包含在專業(yè)指南中（如腫瘤NCCN）作為特定類型腫瘤診療、診療或預(yù)后突變；LevelB，可作為估計(jì)藥品反應(yīng)或耐藥性基于充足研究和教授共識(shí)診療突變，或是基于充足研究和教授共識(shí)含有特定疾病診療、預(yù)后意義突變；LevelC，可作為估計(jì)藥品反應(yīng)或耐藥性FDA或?qū)I(yè)協(xié)會(huì)同意跨適應(yīng)癥診療突變，或是已經(jīng)作為臨床試驗(yàn)入組參考標(biāo)準(zhǔn)，或是基于多項(xiàng)研究含有特定疾病診療、預(yù)后意義突變；LevelD，基于臨床前研究、案例報(bào)道可能含有臨床意義突變；或有研究表明該突變有利于疾病診療和預(yù)后判定。現(xiàn)在，尋求腫瘤驅(qū)動(dòng)基因突變具體策略能夠說是多個(gè)多樣（圖2）。經(jīng)過尋求熱點(diǎn)基因熱點(diǎn)突變（recurrentmutation）是一個(gè)較為確定策略，相關(guān)研究證據(jù)較為充足。比如EGFR突變關(guān)鍵發(fā)生在胞內(nèi)酪氨酸激酶（TK）區(qū)域前四個(gè)外顯子上（18~21），現(xiàn)在發(fā)覺TK區(qū)域突變有30多個(gè)。缺失突變關(guān)鍵發(fā)生在外顯子19上，最常見是delE746-A750，替換突變最常見是發(fā)生在外顯子21上L858R，復(fù)制或插入突變發(fā)生在外顯子20上。發(fā)生在外顯子20上替換突變T790M為耐藥突變，研究還發(fā)覺L858Q、D761Y、T854A等耐藥突變。HER2基因在乳腺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、胃癌中關(guān)鍵突變方法是擴(kuò)增或表示上調(diào)，鮮有突變，在20～30%乳腺癌中存在HER2基因顯著擴(kuò)增或過表示，不過在肺癌中，其激活機(jī)制為擴(kuò)增、過表示及點(diǎn)突變，點(diǎn)突變?cè)诜伟┲邪l(fā)生概率約占2-4%，多發(fā)生在其激酶結(jié)構(gòu)域中，常見激活性點(diǎn)突變包含p.S310,p.L755，p.G776L,p.V777L，p.S855I，p.N857S等。BRAFV600E突變臨床意義在Pubmed中有上百遍報(bào)道。BRAF突變存在于1%–3%非小細(xì)胞肺癌中。V600E是最常見腫瘤驅(qū)動(dòng)突變，在肺癌中也有多個(gè)其它類型BRAF突變被報(bào)道，包含G466V、G469A和D594G。盡管性藥品比如vemurafenib在包含BRAFV600E突變黑色素瘤中高度有效，但這些藥品對(duì)BRAF其它位點(diǎn)突變，或V600E突變肺癌中腫瘤驅(qū)動(dòng)活性還需評(píng)定。圖2

判定驅(qū)動(dòng)基因突變策略（PMID:24479672）熱點(diǎn)基因熱點(diǎn)突變?cè)诤芏鄶?shù)據(jù)庫中有不完全收錄，這些數(shù)據(jù)庫有Civic數(shù)據(jù)庫，OncoKB數(shù)據(jù)庫，Personalizedcancertherapy數(shù)據(jù)庫，ClinicalKnowledgebase數(shù)據(jù)庫等等。估計(jì)變異對(duì)蛋白質(zhì)功效影響，能夠作為尋求腫瘤驅(qū)動(dòng)突變一個(gè)有益補(bǔ)充方法。比較常見估計(jì)工具如SIFT、PolyPhen2、MutationAssessor等等，這些算法原理通常是基于氨基酸進(jìn)化保守性，有考慮到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域功效（比如TP53蛋白有害突變多在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域），還有會(huì)考慮蛋白空間結(jié)構(gòu)。對(duì)于檢測(cè)到變異各算法估計(jì)值在上述vcf文件中可查閱。對(duì)于SIFT，值越小變異有害性可能性越大，推薦閾值0.05；對(duì)于PolyPhen2，值越大變異有害性可能性越大，推薦閾值0.3；對(duì)于MutationAssessor，值越大變異有害性可能性越大，推薦閾值8，需要注意是，不一樣參考文件閾值可能不一樣（PMID:23819521）。將基因放在信號(hào)通路中分析，這對(duì)于不是十分常見小眾腫瘤驅(qū)動(dòng)基因?qū)で笥泻艽髱椭Ｔ诿绹?，每十二個(gè)月有大約18,000名患者被確診為腦膜瘤。它們約占原發(fā)性腦腫瘤三分之一，女性患病比率高一倍。不過一直以來對(duì)于腦膜瘤遺傳突變了解甚少。在一項(xiàng)研究中（PMID:23334667），科學(xué)家們對(duì)17個(gè)腦膜瘤樣本進(jìn)行了全基因組或是外顯子組測(cè)序。在這些腫瘤中發(fā)覺改變基因后，研究人員隨即又對(duì)另外兩組腫瘤進(jìn)行了測(cè)序。研究人員發(fā)覺，相比大多數(shù)類型腫瘤，腦膜瘤含有較少數(shù)量遺傳改變或損傷。在部分腫瘤中，她們發(fā)覺兩個(gè)在已知致癌信號(hào)通路中發(fā)揮作用基因存在突變。在3個(gè)腫瘤中發(fā)覺SMO，是Hedgehog信號(hào)組員。在5個(gè)腫瘤中發(fā)覺了AKT1，該基因參與了和乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌相關(guān)PI3K-AKT-mTOR信號(hào)。第6個(gè)腫瘤含有一個(gè)以前已知，和mTOR信號(hào)通路相關(guān)突變。總來說，這些突變基因信號(hào)通路組成了所研究15%腦膜瘤關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)子。對(duì)于遺傳性腫瘤，能夠借助遺傳病致病基因判定方案，步驟即1、了解臨床資料2、關(guān)鍵表型轉(zhuǎn)化為漢字人類表型標(biāo)準(zhǔn)用語(CHPO)3、基因檢測(cè)及其質(zhì)控4、生信分析5、遺傳學(xué)分析，包含關(guān)聯(lián)候選基因、遺傳變異位點(diǎn)分析解讀和家系驗(yàn)證6、表型相同度分析。ACGM推薦和遺傳性腫瘤/遺傳病相關(guān)基因包含BRCA1、BRCA2、TP53、STK11、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、APC、MUTYH、VHL、MEN1、RET、PTEN、RB1、SDHC、SDHD、TSC1、TSC2、WT1、NF2等（PMID：23788249）。查找正常對(duì)照組織突變豐度（N_Freq）≥40%，比對(duì)遺傳性腫瘤相關(guān)突變基因，是否有遺傳性腫瘤相關(guān)胚系突變，查看并根據(jù)下述步驟進(jìn)行確定。根據(jù)基因名+c.__或基因名+p.__進(jìn)行谷歌搜索或進(jìn)入NCBI、HGMD、OMIM等網(wǎng)站查閱是否有相關(guān)致病性報(bào)道，根據(jù)ACMG指南進(jìn)行位點(diǎn)致病性判定或可借助InterVar在線輔助判定（僅適適用于exon范圍內(nèi)突變）。發(fā)覺遺傳性腫瘤相關(guān)基因突變，還應(yīng)推薦家族其它直系血親進(jìn)行基因檢測(cè)做深入確實(shí)定。美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)（AmericanCollegeofMedicalGeneticsandGenomics,ACMG）和分子病理協(xié)會(huì)（AssociationforMolecularPathology,AMP）在對(duì)臨床試驗(yàn)室基因檢測(cè)進(jìn)行了指導(dǎo)和規(guī)范（PMID:25741868）。該指導(dǎo)規(guī)范關(guān)鍵就是適適用于孟德爾遺傳病相關(guān)基因變異或是生殖系變異。指導(dǎo)規(guī)范推薦記載突變遵照統(tǒng)一規(guī)范——人類基因組變異協(xié)會(huì)（HumanGenomeVariationSociety,HGVS），并將變異依據(jù)人群基因頻率（populationdata）、軟件估計(jì)（computationaldata）和功效試驗(yàn)（functionaldata）等參數(shù)分為五個(gè)等級(jí)：致病性突變（pathogenic）、可能致病性突變（likelypathogenic）、意義不明突變（uncertainsignificance）、可能良性突變（likelybenign）和良性多態(tài)性突變（benign）。這五個(gè)等級(jí)怎樣認(rèn)定？該規(guī)范列出了致病性/可能致病多種情況支持證據(jù)，證據(jù)強(qiáng)度依次包含超強(qiáng)證據(jù)（PVS1）、強(qiáng)證據(jù)（PS1-4，注意這里數(shù)字不代表證據(jù)強(qiáng)度區(qū)分，僅表示同一證據(jù)強(qiáng)度不一樣證據(jù)情