遺傳實驗人外周血培養(yǎng)與染1.學(xué)習(xí)外周血淋巴細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的原理和方法；2.利用培養(yǎng)后進(jìn)行分裂的細(xì)胞制備人類染色體標(biāo)本；3.利用人類染色體核型分析軟件進(jìn)行核型分析。一、實驗?zāi)康模旱?頁,共25頁，2024年2月25日，星期天二、實驗原理：

1、植物血凝素的作用

外周血中的淋巴細(xì)胞幾乎都是處在G0或G1期，一般情況下是不分裂的。當(dāng)在培養(yǎng)基中加入植物血凝素(PHA)時，這種小淋巴細(xì)胞受到刺激后轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，進(jìn)而開始進(jìn)行有絲分裂。第3頁,共25頁，2024年2月25日，星期天

2、秋水仙素的作用：

秋水仙素(colchicine)可以抑制細(xì)胞紡錘體的形成，使處在分裂的細(xì)胞停留在中期。因此利用秋水仙素處理可以獲得許多同步的中期分裂細(xì)胞。使用秋水仙素處理會引起染色體在一定程度上的收縮，因此在處理時間和濃度上要合適。第4頁,共25頁，2024年2月25日，星期天

3、低滲的原理：

徐道覺(T.C.Hsu)等于1952年發(fā)現(xiàn)在固定細(xì)胞之前使用低滲液進(jìn)行處理，可以使細(xì)胞的核膜吸水膨脹，滴片后細(xì)胞破裂，染色體分散開來，在顯微鏡下易于觀察和統(tǒng)計，染色效果也明顯提高。第5頁,共25頁，2024年2月25日，星期天4、核型和帶型：核型(karyotype)：

是指染色體組在有絲分裂中期的表型這種技術(shù)被廣泛采用后，使人類染色體分析技術(shù)得到了發(fā)展。,是染色體數(shù)目、大小、形態(tài)特征的總和。在對染色體進(jìn)行測量計算的基礎(chǔ)上,進(jìn)行分組、排隊、配對,并進(jìn)行形態(tài)分析的過程叫核型分析。將一個染色體組的全部染色體逐條按其特征畫下來，再按長短、形態(tài)等特征排列起來的圖稱為核型模式圖，它代表一個物種的核型模式。第6頁,共25頁，2024年2月25日，星期天帶型（bandingpattern）

即染色體帶型。借助細(xì)胞學(xué)的特殊處理程序，使染色體顯現(xiàn)出深淺不同的染色帶。染色帶的數(shù)目、部位、寬窄和著色深淺均具有相對穩(wěn)定性，所以每一條染色體都有固定的分帶模式，即稱帶型。常用的顯帶技術(shù)所顯示的帶有Q帶、G帶、C帶、R帶、T帶等。就每一種分帶技術(shù)而言，每一染色體的帶型是高度專一和恒定的。第7頁,共25頁，2024年2月25日，星期天三、實驗用具及試劑：實驗儀器及用具：

恒溫培養(yǎng)箱、離心機、恒溫水浴箱、冰箱、顯微鏡、顯微數(shù)碼攝像系統(tǒng)、染色體分析儀；培養(yǎng)瓶、注射器、微量移液器、槍頭、吸管、離心管(10ml)、載玻片、燒杯、量筒。.第8頁,共25頁，2024年2月25日，星期天2.實驗試劑：

外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基

2%碘酒

75%酒精

20μg/ml秋水仙素

0.075mol/LKCl溶液甲醇冰醋酸

Giemsa原液

1/15mol/L磷酸緩沖液

第9頁,共25頁，2024年2月25日，星期天四、實驗步驟：1、采血：將皮膚常規(guī)消毒后靜脈采血約0.5ml。2、種血及培養(yǎng)：將采到的血樣立即接種到培養(yǎng)瓶內(nèi)，每個培養(yǎng)瓶接25－28滴（約0.5ml），輕輕搖勻后將培養(yǎng)瓶放在37℃溫箱中培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)過程中，每天應(yīng)輕輕搖動兩次培養(yǎng)瓶。

3、秋水仙素處理：在終止培養(yǎng)前3-4小時，向培養(yǎng)瓶中加20μg/ml的秋水仙素20μl，輕輕搖勻后繼續(xù)培養(yǎng)到72小時。第10頁,共25頁，2024年2月25日，星期天4、制片：（1）離心：從溫箱中取出培養(yǎng)瓶，用吸管將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入10ml的刻度離心管內(nèi)。2000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘。（2）低滲：棄去上清液。加入37℃預(yù)熱的0.075mol/LKCl低滲液6-8ml，用吸管輕輕吹打均勻，放在37℃恒溫水浴中40分鐘。(此時配固定液：甲醇225ml+冰醋酸75ml)（3）預(yù)固定：在離心管中加入現(xiàn)配的預(yù)溫的甲醇-冰醋酸(3:1)固定液約1ml，輕輕混勻，37℃固定15分鐘。第11頁,共25頁，2024年2月25日，星期天（4）再次離心：2000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。（5）第一次固定：棄上清液，加入固定液約7ml，立即用吸管吹打使之成細(xì)胞懸液，室溫固定20分鐘。2000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。（6）第二次固定：同第一次固定。（7）棄上清液，根據(jù)沉淀量的多少，加入適量固定液6～8滴，用吸管吹打使均勻后制成細(xì)胞懸液。

第12頁,共25頁，2024年2月25日，星期天

（8）滴片：在30-40cm高處將細(xì)胞懸液滴在預(yù)冷的載玻片上，注意動作應(yīng)迅速，避免載片升溫。（9）染色：用10%吉姆薩染液扣染30分鐘，染色結(jié)束后用清水將浮色沖去，干燥后即可進(jìn)行鏡檢。（10）照相：在顯微鏡下尋找分散較好的分裂相(核型)，再置于顯微照相儀下拍攝照片，并保存。（11）核型分析：應(yīng)用核型分析軟件，進(jìn)行染色體核型分析。第13頁,共25頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共25頁，2024年2月25日，星期天核型分析儀及核型分析第15頁,共25頁，2024年2月25日，星期天五、注意事項:

1、秋水仙素處理時間過長，分裂細(xì)胞多，染色體短小；反之，則少而細(xì)長。都不宜觀察形態(tài)及計數(shù)。故秋水仙素的濃度及時間要準(zhǔn)確掌握。

2、低滲使紅細(xì)胞膜破裂，淋巴細(xì)胞膨脹，低滲處理濃度及時間要適當(dāng)。且低滲后混勻細(xì)胞一定要輕，否則引起膜破裂、染色體散失。

3、離心前配平，離心速度過高，細(xì)胞團(tuán)不易打散；反之，細(xì)胞易丟失。

4、固定液應(yīng)在使用前臨時配制。

5、載玻片一定要潔凈，否則染色體分散不好。第16頁,共25頁，2024年2月25日，星期天六、實驗結(jié)果與分析：

染色體核型分析：人類每個體細(xì)胞有46條染色體，22對常染色體和一對性染色體，男性為46，XY；女性為46，XX。第17頁,共25頁，2024年2月25日，星期天

臂比值符號中間著絲粒染色體1~1.7

m近中著絲粒染色體

1.7~3

sm近端著絲粒染色體

3~7

st頂端著絲粒染色體

>7

t第18頁,共25頁，2024年2月25日，星期天A組（No.1～3）：是最大的一組染色體，它們的著絲粒在中部或幾乎在中部，為中部著絲粒染色體；B組（N0.4～5）：為兩對大的亞中部著絲粒染色體，它們有明顯的長臂和短臂；C組（N0.6～12+X）：為中等大小的亞中部著絲粒染色體，它們大小相差不多，X染色體大小介于期間，一般難以區(qū)分；D組（N0.13～15）：為中等大小的近端著絲粒染色體，它們的一個重要形態(tài)特征是隨體，隨體是一對著色很深的小球，處于短臂的末斷，隨體與短臂之間的區(qū)域很少著色；

人類染色體分組第19頁,共25頁，2024年2月25日，星期天E組（N0.16～18）：包括一對中著絲粒染色體（16）和兩對亞中著絲粒染色體（17、18）；F組（N0.19～20）：為兩對小的中部著絲粒染色體；G組（N0.21～22+Y）：為最小的一組近端著絲粒染色體，在N0.21～22的短臂上可見隨體。Y染色體常呈現(xiàn)異固縮狀態(tài)，著色更深，可以識別。

人類染色體核型分析結(jié)果

第20頁,共25頁，2024年2月25日，星期天重要參數(shù)：（1）染色體的相對長度（2）臂比率（3）著絲點指數(shù)第21頁,共25頁，2024年2月25日，星期天第22頁,共25頁，2024年2月25日，星期天七、作業(yè)及思考題：1、將分散良好的標(biāo)本進(jìn)行顯微照相；2、觀察人類染色體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特點；3、對比男性和女性的染色體標(biāo)本，比較異同；4、總結(jié)做好本實驗的關(guān)鍵因素。第23頁,共25頁，2024年2月25日，星期天八、參考文獻(xiàn)：醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)基礎(chǔ)與臨床.