HPLC色譜知識及應(yīng)用反相分配色譜極性:固定相<流動相 固定相-非極性 流動相(甲醇,乙腈）-極性 非極性物質(zhì)后出峰正相吸附色譜

極性:固定相>流動相 固定相-極性 流動相(己烷,庚烷)-非極性 極性物質(zhì)后出峰正相色譜20%反相色譜80%正相&反相色譜

硅膠基質(zhì)-pH3~8Al2O3

.nH2O-pH1~14

聚合物基質(zhì)-pH1~14高或低pH下,硅膠會溶解化學(xué)修飾困難孔結(jié)構(gòu)復(fù)雜,孔徑不均勻?qū)е轮Р粔蚋?有機(jī)溶劑可能導(dǎo)致聚合物基質(zhì)溶漲而受損柱填料基質(zhì)硅膠純度 ?填料硅膠的純度與殘留金屬離子濃度色譜柱尺寸 ?填料床的長度和內(nèi)徑顆粒形狀 ?球型或不規(guī)則型粒徑 ?平均顆粒直徑,通常3-10μm表面積 ?顆粒外表面和內(nèi)部孔表面的總和,以m2/gram表示孔徑 ?顆粒的孔或腔的平均尺寸,范圍80-300?色譜柱物理性質(zhì)C-18柱---性能影響因素鍵合類型 ?單體鍵合-鍵合相分子與基體單點(diǎn)相連 ?聚合體鍵合-鍵合相分子與基體多點(diǎn)相連碳覆蓋率 ?鍵合相的鍵合量常用含碳量(C%)來表示，也可以用覆蓋度來表示。所謂覆蓋度是指參與反應(yīng)的硅醇基數(shù)目占硅膠表面硅醇基總數(shù)的比例。封端

?鍵合步驟之后,用短鏈將裸露的硅羥基鍵合后封閉起來色譜柱化學(xué)性質(zhì)C-18柱---性能影響因素A類硅膠OriginalZORBAXSIL(1970s)由于帶負(fù)電荷的殘留硅羥基和酸性表面上金屬含量高(硅羥基的pKa低),導(dǎo)致堿性化合物發(fā)生拖尾B類硅膠(高純)ZORBAXRx-Sil(1987)由于金屬含量低,硅羥基pKa高,堿性化合物不發(fā)生拖尾C-18柱---性能影響因素色譜柱尺寸---對色譜分離的影響 ?短柱(15-100mm)-運(yùn)行時間短,柱壓低 ?長柱(150-250mm)-分辨率高,運(yùn)行時間長 ?窄徑柱(

2.1mm)-檢測器靈敏度高 ?寬徑柱(3-21.2mm)-載樣量高C-18柱---性能影響因素顆粒形狀---對色譜分離的影響

當(dāng)使用黏度較大的流動相50:50=MeOH:H2O時,球型顆?？梢越档椭鶋?延長色譜柱壽命C-18柱---性能影響因素球形不規(guī)則形粒徑---對色譜分離的影響

較小的顆粒柱效較高,但會引起柱壓過高.3.5μm粒徑的常用于分離復(fù)雜的多組份樣品,而組份單一的樣品多采用5μm的粒徑1.8μm3.5μ5μm 7μm 10μm表面積---對色譜分離的影響

高表面積對于多組份樣品的分離具有較強(qiáng)的保留能力,柱容量和分離度.表面積低的填料通常能迅速達(dá)到平衡狀態(tài),對于梯度淋洗尤為重要C-18柱---性能影響因素孔徑---對色譜分離的影響

大孔的填料顆?？梢匝娱L溶質(zhì)大分子在填料表面滯留的時間,達(dá)到充分分離,改善峰形樣品MW

4,000,選擇80?的孔徑樣品MW>4,000,選擇300?的孔徑鍵合類型---對色譜分離的影響

單齒鍵合：提高傳質(zhì)速率,加快色譜柱平衡雙齒鍵合：增加色譜柱穩(wěn)定性,增加色譜柱的載樣量C-18柱---性能影響因素CHCHCHCHCHCHOSiOOOOSiSiSiCHCHCHCHCHCHSi333333333333SiSiOOSiSiOO碳覆蓋率---對色譜分離的影響

高碳覆蓋率：提高分辨率,分析時間長低碳覆蓋率：縮短運(yùn)行時間封端---對色譜分離的影響

封端：減輕待測組份與硅膠表面殘留的酸性硅羥基反應(yīng)而引起的色譜峰拖尾現(xiàn)象對于極性樣品,未封端與經(jīng)過封端處理的色譜柱在選擇性上有明顯差異C-18柱---性能影響因素固定相鍵合二甲基硅烷

封端四甲基硅烷SiOOHOOCH3SiRCH3CH3SiCH3CH3SiRCH3R=C8,

C18,

etc.OOHOHOCH3SiRCH3CH3SiRCH3++ClCH3SiCH3CH3OHOHOHOHCH3ClRCH3(TMS)傳統(tǒng)鍵合及封端技術(shù)鍵合相種類化學(xué)鍵合相按鍵合官能團(tuán)的極性分為極性和非極性鍵合相兩種。

極性鍵合相：氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)——常用作正相色譜，極性強(qiáng)的組分保留值較大。極性鍵合相有時也可作反相色譜的固定相。非極性鍵合相：各種烷基(C1~C18)和苯基、苯甲基，極性弱的組分保留值較大。

HPLC---色譜柱與pH的關(guān)系StableBondC18pH1~8

Bonus-RPpH2~9

ExtendC18pH2~11.5

EclipseXDBC18pH2~9

（可用于100%全水相）未封端雙封端三封端雙封端HPLC---保留值與pH的關(guān)系

pH變化值0.1RS變化值1.6色譜柱：ZorbaxStableBondC184.6X250mm,5um流動相：27%甲醇：73%磷酸pH2.5&2.6溫度：500C流速：1.0mL/min.鄰氯苯胺（pKa＝2.636)12346750123456Time(min)01234561234675Time(min)pH7.00pH7.25色譜柱:ZORBAXEclipseXDB-C84.6x75mm,3.5μm流動相:44%25mM磷酸,pH7.00:56%甲醇流速:1.0mL/min溫度:25°C檢測:UV250nm可電離的組份的分離可能會隨pH變化發(fā)生顯著變化—甚至很小的0.05–0.25個pH變化單位.樣品:ketoprofenethylparabenHydrocortisonefenoprofenpropylparabenPropranolol(游離堿pka9.5）

ibuprofenHPLC---保留值與pH的關(guān)系0.25個pHHPLC---保留值與pH的關(guān)系pH變化：0.2個pH(7.0~7.2)保留時間改變：1.2分鐘(13.6~14.8分鐘)保留時間隨pH改變不明顯保留時間隨pH改變不明顯(酸性環(huán)境中)（PKa：2.98）（PKa：10.1）保留時間酸性組份中性組份堿性組份方法穩(wěn)定區(qū)方法波動區(qū)(pKa+1.5)

方法穩(wěn)定區(qū) HPLC---保留值與pH的關(guān)系復(fù)雜組分的流動相pH選擇技巧色譜柱:ZORBAXExtend-C184.6x150mm,5mm流動相:30%緩沖液:70%MeOHpH7緩沖液20mMNa2HPO4pH11緩沖液20mMTEA流速:1.0mL/min

溫度:RT 檢測器:UV254nm0512,345Time(min)76Extend-C18pH71.Maleate馬來酸鹽2.Scopolamine東莨菪堿pKa7.63.PseudoEphedrine假麻黃堿pKa9.84.Doxylamine抗敏安(多西拉敏)pKa9.25.Chlorpheniramine氯苯吡胺pKa9.16.Triprol內(nèi)徑ine苯丙烯啶pKa6.57.Diphenhydramine苯海拉明pKa9.0Extend-C18pH1105101234Time(min)657高pH下,堿性成分的保留增加待測物pKa+1.5以外的流動相pH可保證方法的穩(wěn)定性樣品溶劑溶解強(qiáng)度樣品溶劑溶解能力強(qiáng)于流動相導(dǎo)致色譜峰峰形問題：裂分峰或?qū)挿迳V柱:ZORBAXStableBondSB-C8,4.6x150mm,5mm流動相:82%H2O:18%ACN進(jìn)樣體積:30mLA. 樣品溶劑 100%乙腈010Time(min)12B. 樣品溶劑 流動相010Time(min)12樣品:1.Caffeine(咖啡因)2.Salicylamide(水楊酰胺)中性分析時為何要使用緩沖液？色譜柱:ZORBAXEclipseXDB-C8,4.6x75mm,3.5μm流動相:44%A:56%甲醇流速:1.0mL/min 溫度:25°C 檢測:UV250nm含緩沖液的流動相可改善保留,分離和色譜峰峰形.樣品:1.ketoprofen2.ethylparaben3.hydrocortisone4.fenoprofen5.propylparaben6.propranolol7.ibuprofenA=pH7.0水A=pH7.0水+25mM磷酸緩沖液012345Time(min)1234675012341,4,6,7235Time(min)02.55.07.5Time(min)12345602.55.0Time(min)123456增加緩沖液濃度減少拖尾色譜柱: ZORBAXEclipseXDB-C8 4.6x150mm,5mm流動相: 40%磷酸鹽緩沖液 60%ACN流速: 1.5mL/min.溫度: 40°CUSPTf1.621.651.631.771.831.1210mM磷酸鹽pH7.0USPTf1.411.501.331.391.361.0025mM磷酸鹽pH7.0在中等pH下,離子強(qiáng)度較高,能有效掩蔽硅羥基的二次作用減少拖尾樣品: TricyclicAntidepressants（三環(huán)抗抑郁劑）1.Desipramine（脫甲丙咪嗪）2.Nortriptyline（去甲替林）3.Doxepin（多塞平）4.Imipramine（丙咪嗪）5.Amitriptyline（阿米替林）6.TrImipramine（三甲丙咪嗪）三乙胺對堿性成分峰形的影響02.55.0Time(min)12345色譜柱:ZORBAXEclipseXDB-C8,4.6x150mm,5mm流動相:85%25mMNa2HPO4:15%ACN流速:1.0mL/min.溫度:35°CUSPTF5%1.1.29 2.1.333.1.634.2.355.1.57No三乙胺10Mm三乙胺USPTF5%1.1.192.1.183.1.204.1.265.1.14Time(min)0.02.55.035421pH7樣品:1.Phenylpropanolamine（去甲麻黃堿）2.Ephedrine（麻黃素）3.Amphetamine（苯丙胺）4.MethAmphetamine（脫氧麻黃堿）5.Phenteramine（苯丁胺）競爭酸對酸性組分的峰形的影響色譜柱: ZORBAXStableBondSB-C184.6x150mm,5mm流動相: 40%A:60%ACN流速: 1.0mL/min.溫度: 室溫樣品: Ibuprofen（異丁苯丙酸）pKa4.4pH35mMNaH2PO4Tf=1.8pH35mMNaH2PO41%乙酸pH2.55mMNaH2PO40.1%三氟乙酸Tf=1.0Tf=1.09A:乙酸和三氟乙酸均能作為競爭酸填加至流動相中三氟乙酸由于所需濃度較低,可作為首選液相分析-小訣竅提高柱溫，可增加柱效（提高靈敏度）減小柱內(nèi)徑，可增加柱效（提高靈敏度）縮短檢測器響應(yīng)時間，可增加柱效（提高靈敏度）減小柱外體積，可增加柱效（提高靈敏度）使用超純硅膠，可增加柱效（提高靈敏度）使用高能量氘燈，可增加柱效（提高靈敏度）使用中孔透光氘燈，可增加柱效（提高靈敏度）改變流動相pH，可增加柱效（提高靈敏度）改變有機(jī)相%

，可增加柱效（提高靈敏度）改變鍵合相

，可增加柱效（提高靈敏度）改變有機(jī)添加劑

，可增加柱效（提高靈敏度）改變流動相配比方式

，可增加柱效（提高靈敏度）樣品: 除草劑 流動相: 52/480.1M乙酸鈉/甲醇,pH6 流速: 0.45mL/min 溫度: 40℃,90℃ 檢測: UV 柱溫的影響1.西瑪津2.敵草隆3.撲滅津4.撲滅凈5.異丙甲草胺液相色譜柱:ZorbaxStableBond-C18色譜柱尺寸:4.6x150mm,5μm40℃90℃ 提高柱溫，可增加柱效（提高靈敏度）液相色譜柱:ZorbaxStableBond-C8色譜柱尺寸:150mm,5μm減小毛細(xì)管內(nèi)徑來提高低濃度樣品的檢測靈敏度流動相: 60%乙腈/40%水 流速: 內(nèi)徑0.3mm-4uL/min

內(nèi)徑0.5mm-10uL/min

內(nèi)徑1.0mm-50uL/min

內(nèi)徑4.6mm-1.0uL/min 溫度: 室溫 檢測器: UV254nm 樣品: 200ng聯(lián)二苯(100nl) 減小柱徑，可增加柱效（提高靈敏度）色譜柱使用小體積色譜柱對于檢測器響應(yīng)時間的重要性(TE32)液相色譜柱:ZORBAXStableBond-C18色譜柱尺寸:4.6x15mm3.5μm流動相:乙腈:1%甲酸=32:68UV:254nm流速:1.0mL/min.30°C進(jìn)樣量:5μL響應(yīng)時間:4.0秒響應(yīng)時間:2.0秒響應(yīng)時間:1.0秒響應(yīng)時間:0.5秒響應(yīng)時間:0.1秒尿嘧啶乙酰水楊酸N-乙酰苯胺縮短檢測器響應(yīng)時間，可增加柱效（提高靈敏度）色譜柱不同硅膠類型比較(TE1)流動相:含0.05%甲醇的二氯甲烷

液相色譜柱ZorbaxSilSpherisorbZorbaxRx-Sil甲苯N-苯甲酰苯胺苯酚苯甲醇使用高純硅膠，可增加柱效（提高靈敏度）pH對苯胺取代物分析的影響流動相25mM磷酸:甲醇=58:42流速:1mL/min22°C液相色譜柱:ZORBAXStableBond-C18色譜柱尺寸:4.6x150mm5μm對位甲氧基苯胺間位苯甲胺(苯甲胺PKb=9.15)3-氨基-苯甲腈對位氯苯胺間位氯苯胺鄰位氯苯胺（pka=2.636）pH:2.5pH:7.0 改變流動相pH，可增加柱效（提高靈敏度）三氟乙酸濃度對于反相肽的分離的影響(B10) 流動相:A:水和三氟乙酸B:乙腈和三氟乙酸0-30%B（30min.內(nèi)）流速:1mL/minUV:254nm進(jìn)樣量:6uL十肽菌素標(biāo)樣S1-S5（疏水性有略微差異）40°C液相色譜柱:ZORBAX300SB-C8色譜柱尺寸:4.6x150mm5μm1.0%三氟乙酸0.05%三氟乙酸0.25%三氟乙酸改變流動相pH，可增加柱效（提高靈敏度）有機(jī)改性劑和pH對于選擇性的影響流動相:25mM磷酸緩沖液流速:1.0mL/min.22°C液相色譜柱:ZORBAXStableBond-CN色譜柱尺寸:4.6x150mm5μm甲氧基苯胺間位苯甲胺4-氯-苯胺3-氨基苯甲腈3-氯-苯胺2-氯-苯胺42%甲醇：58%緩沖液 30%甲醇：70%緩沖液pH2.6pH3.0改變有機(jī)相%，可增加柱效（提高靈敏度）色譜柱的選擇性液相色譜柱:ZORBAXEclipseXDB-Phenyl色譜柱尺寸:4.6x150mm5μm流動相:甲醇:水=70:30UV:254nm流速:1.0mL/min.室溫ZorbaxEclipseXDB-苯基ZorbaxEclipseXDB-C8ZorbaxEclipseXDB-C18尿嘧啶苯酚4-氯-硝基苯甲苯萘改變鍵合相，可增加柱效（提高靈敏度）流動相對色譜的影響液相色譜柱:ZORBAXEclipseXDB-C8色譜柱尺寸:4.6x50mm3.5μmUV:254nm流速:1mL/min.室溫尿嘧啶尼帕爾金丁酯萘二丙