農(nóng)產(chǎn)品中生氰糖苷的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口。本文件起草單位：中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所、浙江大學(xué)、中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院、北京林業(yè)大學(xué)。姚慶群。1農(nóng)產(chǎn)品中生氰糖苷的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法1范圍苷、蜀黍苷、苦杏仁苷、黑野櫻苷的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。本文件適用于木薯、亞麻籽、高粱、竹筍、杏仁等農(nóng)產(chǎn)品中生氰糖苷含量的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。試樣中生氰糖苷，經(jīng)80%甲醇水溶液提取，固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，外標(biāo)法定量。5試劑和材料除非另有說(shuō)明，在分析中僅使用分析純?cè)噭?，以及符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。5.1試劑5.2試劑配制5.2.10.1%甲酸水溶液(體積分?jǐn)?shù)):準(zhǔn)確吸取1.00mL甲酸(5.1.3),用水定容至1L。5.2.280%甲醇水溶液(體積分?jǐn)?shù)):量取80mL甲醇(5.1.1),加20mL水，混勻。5.2.310%甲醇水溶液(體積分?jǐn)?shù)):量取10mL甲醇(5.1.1),加90mL水，混勻。5.2.430%甲醇乙腈溶液(體積分?jǐn)?shù)):量取30mL甲醇(5.1.1),加70mL乙腈(5.1.2),混勻。25.3標(biāo)準(zhǔn)品8種生氰糖苷標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥95%,其基本信息見(jiàn)附錄A。5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制5.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(100mg/L):分別準(zhǔn)確稱取生氰糖苷標(biāo)準(zhǔn)品約5mg(精確至0.01mg),用甲醇(5.1.1)溶解，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用甲醇(5.1.1)定容，配成質(zhì)量濃度為100mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于一18℃保存，保存期2個(gè)月。5.4.2標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(1mg/L):分別移取100μL的8種生氰糖苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(5.4.1)于10mL棕色容量瓶中，用甲醇(5.1.1)定容，得1mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液?，F(xiàn)配現(xiàn)用。5.5.1固相萃取柱：N-乙烯吡咯烷酮和二乙烯基苯共聚物填料柱(200mg/6mL),或其他等效柱。使用前用2mL甲醇和2mL水依次活化。5.5.2微孔濾膜：0.22μm有機(jī)系。6儀器和設(shè)備6.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源。6.2分析天平：感量0.1mg和0.01mg。6.3分析研磨機(jī)。6.4渦旋振蕩器。6.5離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥4200r/min,帶有15mL轉(zhuǎn)子。6.6固相萃取裝置。6.7超聲波清洗器(總功率900W)。6.8氮吹儀。7試樣制備與保存取500g左右樣品，用水洗凈表面附著的雜物，吸水紙擦干水分，切碎，裝入樣品入研磨杯，加入液氮冷凍，用研磨機(jī)粉碎至顆粒均勻，放入分裝容器中，密封，按照第8章規(guī)定的順序完成，或放于一18℃凍存1個(gè)月。8測(cè)定步驟8.1提取稱取1g試樣(精確到0.1mg)于15mL離心管中，加入3mL80%甲醇水溶液(5.2.2),渦旋振蕩15s,超聲提取15min,立即于4200r/min離心10min,取全部上清液；向殘?jiān)性俅渭尤?mL80%甲醇水溶液(5.2.2),按上述條件提取、離心，合并兩次提取液于10mL容量瓶中，加水至刻度線，混勻，將活化好的固相萃取柱(5.5.1)連接到固相萃取裝置(6.6),將8.1中制備的粗提液轉(zhuǎn)移至萃取柱3中，待樣液全部流過(guò)柱子后，棄去流出液。用2mL水淋洗柱子并徹底抽干，棄去淋洗液。用3mL30%甲醇乙腈溶液(5.2.4)洗脫柱子，分次洗脫，每次1mL,流速1mL/min,收集全部洗脫液。洗脫液氮?dú)獯蹈?40℃)后，用1mL10%甲醇水溶液(5.2.3)復(fù)溶。過(guò)0.22μm濾膜(5.5.2),供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。8.3測(cè)定液相色譜參考條件如下：a)色譜柱：C??(50mm×2.1mm,1.8μm)色譜柱，或同等性能的色譜柱；b)流動(dòng)相及洗脫條件見(jiàn)表1;表1流動(dòng)相及梯度洗脫參考條件時(shí)間min流動(dòng)相A(0.1%甲酸水溶液)%流動(dòng)相B(乙腈)%22728.3.2質(zhì)譜參考條件質(zhì)譜參考條件如下：a)離子源：電噴霧離子源；b)掃描方式：正離子掃描模式；c)干燥氣溫度：325℃;d)干燥氣流量：5L/min;e)鞘氣溫度：350℃;f)鞘氣流速：11L/min;g)霧化氣壓力：45MPa;h)毛細(xì)管電壓：3500V;i)檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；j)監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞能量見(jiàn)表2。4中文名稱英文名稱保留時(shí)間min定量離子對(duì)m/z定性離子對(duì)m/z碰撞能量裂解電壓V亞麻苦苷Linamarin270.0/243.2270.0/185.1270.0/243.2β-龍膽二糖丙酮氰醇Linustatin2.097432.2/405.1432.2/347.1432.2/405.1百脈根苷Lotaustralin3.340284.1/257.1284.1/185.1284.1/257.1β-龍膽二糖甲乙酮氰醇Neolinustatin3.366446.2/419.1446.2/347.1446.2/419.1紫杉氰苷Taxiphyllin3.471334.1/185.1334.1/145.08334.1/185.1蜀黍苷Dhurrin3.635334.1/185.1334.1/145.08334.1/185.1苦杏仁苷Amygdalin4.824480.2/347.1480.2/374.1480.2/347.1黑野櫻苷Prunasin5.221318.0/185.1318.0/185.1318.0/79.08.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取適量標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(5.4.2),用10%甲醇水溶液(5.2.3)稀釋成5μg/L、10μg/L、25μg/L、50μg/L、黍苷、苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，以及25μg/L、50μg/L、100μg/L、150μg/L、200μg/L的黑野櫻苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定，以待測(cè)物的特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，待測(cè)物在樣品中的保留時(shí)間與在標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中的保留時(shí)間偏差在士2.5%以內(nèi)，并且色譜圖中各組分定性離子對(duì)的相對(duì)豐度，與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)工作液中相應(yīng)定性離子對(duì)的相對(duì)豐度相比，偏差不超過(guò)表3規(guī)定的范圍，則可判斷為樣品中存在對(duì)應(yīng)的待測(cè)物。表3定性測(cè)定時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差相對(duì)離子豐度最大允許偏差士25%58.3.5定量測(cè)定用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液，以色譜峰面積按外標(biāo)法定量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到化合物濃度，平行測(cè)定不少于兩次。當(dāng)樣品中化合物濃度超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍時(shí)，用10%甲醇水溶液(5.2.3)適當(dāng)稀釋。在上述色譜和質(zhì)譜條件下，8種生氰糖苷的特征離子質(zhì)量色譜圖見(jiàn)附錄B。9結(jié)果計(jì)算與表述試樣中生氰糖苷化合物含量w;按式(1)計(jì)算： (1)式中：p——由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得試樣溶液中生氰糖苷化合物的質(zhì)量濃度，單位為微克每升(μg/L);V——樣品溶液定容體積，單位為毫升(mL);m——試樣質(zhì)量，單位為克(g);f——稀釋倍數(shù)。計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。10精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立的測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不大于算術(shù)平均值的20%11檢出限與定量限生氰糖苷化合物的檢出限和定量限見(jiàn)表4。表4生氰糖苷化合物檢出限與定量限單位為微克每千克化合物名稱檢出限定量限亞麻苦苷5β-龍膽二糖丙酮氰醇5百脈根苷15β-龍膽二糖甲乙酮氰醇5紫杉氰苷5蜀黍苷苦杏仁苷2黑野櫻苷6(資料性)中文名稱英文名稱CAS號(hào)分子式相對(duì)分子質(zhì)量主要農(nóng)產(chǎn)品亞麻苦苷LinamarinC?H?NO?木薯β-龍膽二糖丙酮氰醇Linustatin72229-40-4C?H??NO?409.388木薯百脈根苷LotaustralinC?H??NO?亞麻籽β-龍膽二糖甲乙酮氰醇Neolinustatin72229-42-6C?H??NO?423.415亞麻籽紫杉氰苷Taxiphyllin21401-21-8C?H?NO?竹筍蜀黍苷Dhurrin499-20-7C?H?NO?高粱苦杏仁苷Amygdalin29883-15-6C??H??NO?457.432杏仁黑野櫻苷Prunasin99-18-3C?H?NO杏仁7響應(yīng)值響應(yīng)值(資料性)8種生氰糖苷特征離子質(zhì)量色譜圖保留時(shí)間/min保留時(shí)間/mina)亞麻苦苷定量離子色譜圖c)β-龍膽二糖丙酮氰醇定量離子色譜圖b)亞麻苦苷定性離子色譜圖保留時(shí)問(wèn)/mind)β-龍膽二糖丙酮氰醇定性離子色譜圖圖B.18種生氰糖苷的特征離子質(zhì)量色譜圖8響應(yīng)值響應(yīng)值保留時(shí)間/min保留時(shí)間/minf)百脈根苷定性離子色譜圖保留時(shí)間/min保留時(shí)間/ming)β-龍膽二糖甲乙酮氰醇定量離子色譜圖保留時(shí)問(wèn)/mini)紫杉