微生物工程考試考點(diǎn)總結(jié)一.名詞解釋微生物工程：指采用現(xiàn)代工程技術(shù)手段，利用微生物的某些特定功能，為人類生產(chǎn)有用的產(chǎn)品，或直接把微生物應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程的一種技術(shù)。拮抗作用：當(dāng)多種物質(zhì)聯(lián)合作用時(shí)，其中的一種物質(zhì)會(huì)通過(guò)一定渠道降低另一種物質(zhì)的作用（通常是有害作用），使機(jī)體維持平衡狀態(tài)。例如當(dāng)人體血糖含量較高時(shí)，胰島素分泌增加，胰高血糖素分泌減少，兩種激素桔抗作用使血糖的含量降低。當(dāng)血糖含量較低時(shí)，胰島素分泌減少，胰高血糖素分泌增加，結(jié)果是使血糖的含量升高。生物測(cè)定：利用某些生物對(duì)某些物質(zhì)(如維生素、氨基酸)的特殊需要，或?qū)δ承┪镔|(zhì)(如激素、抗生素、藥物等)的特殊反應(yīng)來(lái)定性、定量測(cè)定這些物質(zhì)的方法。載體：可以插入核酸片段、能攜帶外源核酸進(jìn)入宿主細(xì)胞，并在其中進(jìn)行獨(dú)立和穩(wěn)定的自我復(fù)制的核酸分子。質(zhì)粒：細(xì)胞中獨(dú)立于染色體之外，能夠獨(dú)立復(fù)制的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA.菌落原位雜交：是將細(xì)菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將DNA烘干固定于膜上與放射性同位素標(biāo)記過(guò)的探針雜交，放射自顯影檢測(cè)菌落雜交信號(hào)，并與平板上的菌落對(duì)位。效價(jià)：抗生素的計(jì)量單位，是抗生素等生物制品有效成分含量高低的指標(biāo)，可以通過(guò)儀器的方法測(cè)得。復(fù)制起始位點(diǎn)：指在DNA轉(zhuǎn)錄時(shí)RNA聚合酶與之結(jié)合，起始轉(zhuǎn)錄的特定核苷酸序列，決定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄頻率。BOD（生物需氧量）：通常表示水中有機(jī)物等需氧污染物質(zhì)含量的一個(gè)綜合指示。水中有機(jī)物由于微生物的生化作用進(jìn)行氧化分解，使之無(wú)機(jī)化或氣體化時(shí)所消耗水中溶解氧的總數(shù)量。半連續(xù)發(fā)酵：指在發(fā)酵過(guò)程的后期周期性地放出部分含有產(chǎn)物的發(fā)酵液，然后再補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基的發(fā)酵方法。這種發(fā)酵可以重復(fù)多次。半連續(xù)發(fā)酵semi-continuousfermentation：是指在補(bǔ)料－分批發(fā)酵的基礎(chǔ)上，間歇地放掉部分發(fā)酵液的培養(yǎng)方法。補(bǔ)充發(fā)酵：指在發(fā)酵過(guò)程中以一定的速率排出成熟的發(fā)酵液，同時(shí)以相同的速率加入新鮮培養(yǎng)基，使整個(gè)發(fā)酵過(guò)程基本維持在穩(wěn)定期的發(fā)酵方法。抗生素：是由微生物（包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬）或高等動(dòng)植物在生活過(guò)程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)。下游處理：特指生物工程產(chǎn)品生產(chǎn)程序中的后期加工。指的是生物產(chǎn)品特別是發(fā)酵液的分離、純化、加工、劑型制備等，直至達(dá)到產(chǎn)品質(zhì)量要求的整個(gè)處理過(guò)程。二.簡(jiǎn)答題1.

基因工程在微生物工程的應(yīng)用表現(xiàn)在哪些方面？每一方面舉例1-2個(gè)說(shuō)明。答：①生產(chǎn)藥物疫苗中的引用：這類基因工程藥物的生產(chǎn)是當(dāng)前基因工程最重要的應(yīng)用領(lǐng)域，發(fā)展迅速。例如：有抗腫瘤.抗病毒功能干擾素.白細(xì)胞等；用于生理調(diào)節(jié)的胰島素和其他生長(zhǎng)激素等。②改造傳統(tǒng)工業(yè)發(fā)酵菌種：例如生產(chǎn)抗生素.氨基酸.有機(jī)酸.酶制劑等，這類菌種基本上都要經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的誘變或重組育種，生產(chǎn)性能很難再大幅度的提高。要打破這一局面，必須使用基因工程的手段才能解決。目前在氨基酸.酶制劑等領(lǐng)域已有大量成功的例子。③環(huán)境保護(hù)：在環(huán)境保護(hù)方面，利用基因工程可培育同時(shí)能分解多種有毒物質(zhì)的遺傳工程菌。如：1975年，有人把降解芳烴，萜烴和多環(huán)芳烴的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到能降解Pesudomonas.sp（一種假單胞菌）中，獲得了能同時(shí)降解4種烴類的‘超級(jí)菌’，它能把原油2/3的烴分解掉。2.

作為基因工程載體系統(tǒng)，其載體需要具備哪些條件？答：載體：外源DNA不易進(jìn)入受體細(xì)胞，他需要與某種工具重組后才能導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以進(jìn)行克隆和保存或者表達(dá)外源DNA中的遺傳信息。這種將外源DNA攜帶進(jìn)受體細(xì)胞的工具稱為載體。理想的載體應(yīng)具備以下幾個(gè)條件：①能穩(wěn)定復(fù)制，目的基因的插入基本不影響載體的復(fù)制能力；②應(yīng)具有一個(gè)以上的單一限制酶位點(diǎn)，以便目的基因的插入；③具有某些容易檢測(cè)的遺傳標(biāo)記，以便利用這些標(biāo)記篩選克隆；④插入目的基因的幅度較寬；⑤分力量小，拷貝數(shù)高；⑥從生物防護(hù)角度考慮是安全的。3.

質(zhì)粒構(gòu)建的策略要考慮哪些方面。答：（1）構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體應(yīng)該是能在轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞中進(jìn)行有效的復(fù)制，并且作為質(zhì)粒克隆載體，希望在受體細(xì)胞中有較多的拷貝數(shù)。為此，構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體必須含有能在受體細(xì)胞內(nèi)有效復(fù)制的質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)（ori），最好是松弛型質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)。（2構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體必須含有允許外源DNA片段克隆的位點(diǎn)，并且這樣的克隆位點(diǎn)應(yīng)盡可能多。（3）構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體必須含有供選擇克隆子的標(biāo)記基因。一個(gè)質(zhì)?？寺≥d體最好有兩種選擇標(biāo)記基因，并且在選擇標(biāo)記基因區(qū)內(nèi)有合適的克隆位點(diǎn)。當(dāng)外源DNA片段插入克隆位點(diǎn)后，標(biāo)記基因失活，成為選擇克隆子的依據(jù)。（4）構(gòu)建的質(zhì)粒克隆載體DNA分子應(yīng)盡可能的小。由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞的效率同質(zhì)粒DNA分子大小相關(guān)，小分子質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率高，大于15kb的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率明顯下降。質(zhì)?？寺≥d體DNA分子小，意味著可承載較大的外源DNA片段。（5）根據(jù)特殊需要，使構(gòu)建的質(zhì)粒克隆載體中組裝各種“元件”（小DNA片段），構(gòu)建成不同用途的質(zhì)粒克隆載體。4.

目的基因的檢測(cè)與鑒定要開(kāi)展哪些方面著手？簡(jiǎn)述之。答：①耐藥性標(biāo)志篩選擇（插入失活法）：如果克隆載體攜帶耐藥性標(biāo)志基因，轉(zhuǎn)化后只有含有耐藥基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)菌才能在含有該抗生素的培養(yǎng)基上面形成菌落，這樣可以將轉(zhuǎn)化菌與非轉(zhuǎn)化菌區(qū)別開(kāi)來(lái)。如果重組DNA的外源基因插入基因內(nèi)，標(biāo)志基因失活。②標(biāo)志補(bǔ)救：如果克隆基因能夠在宿主菌表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物與宿主菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)，那么久可以利用營(yíng)養(yǎng)突變菌株進(jìn)行篩選，這就是標(biāo)志補(bǔ)救。③分子雜交法：這是利用32P標(biāo)記的探針與轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上的轉(zhuǎn)化子DNA或克隆的DNA片段進(jìn)行分子雜交，直接選擇并鑒定目的基因。④PCR篩選法：根據(jù)目的基因兩端已知核苷酸序列設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡呐c要求的不同，快速抽提宿主細(xì)胞質(zhì)粒DNA或染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，將擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，若出現(xiàn)特異片段的擴(kuò)增條帶，即說(shuō)明該克隆為陽(yáng)性克隆。⑤免疫學(xué)方法：如果克隆基因的蛋白產(chǎn)物已知的，可利用特異抗體與目的基因表達(dá)產(chǎn)物相互作用進(jìn)行篩選，因此屬非直接選擇法。⑥D(zhuǎn)NA序列分析法：對(duì)DNA分子序列鑒定是驗(yàn)證外源基因是否正確的最確鑿證據(jù)。5.

限制性核酸內(nèi)切酶的類型有哪些？各有何主要特征。答：限制性核酸內(nèi)切酶是可以識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。根據(jù)限制酶的結(jié)構(gòu),輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第一型、第二型及第三型。第一型限制酶：兼具限制切割和修飾兩種功能，但是識(shí)別位點(diǎn)并非嚴(yán)格專一，需要Mg2+.ATP和S-腺苷酰蛋氨酸做為催化反應(yīng)的輔因子，在講解DNA時(shí)，伴有ATP的水解。第二型限制酶：其限制-修復(fù)系統(tǒng)由一對(duì)酶（同一序列的限制酶和甲基化酶）組成，分子量較小，僅需要Mg2+做為輔因子，不需要ATP，識(shí)別位點(diǎn)專一，并在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)講單鏈切斷。因此二型限制酶在基因工程應(yīng)用廣泛，通常說(shuō)的限制酶就是Ⅱ型酶。第三型限制酶：兼具限制切割和修飾兩種功能，識(shí)別位點(diǎn)專一，但是切點(diǎn)不專一，往往不在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)部，需要Mg2+.ATP和S-腺苷酰蛋氨酸做為催化反應(yīng)的輔因子，在講解DNA伴隨ATP水解。6.在基因工程中，以細(xì)菌轉(zhuǎn)化為例，說(shuō)明其轉(zhuǎn)化的原理和技術(shù)？答：在基因工程中經(jīng)歷了獲取目的基因及其與載體連接后，接下來(lái)是重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞的方法包括：轉(zhuǎn)到作用和轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。以轉(zhuǎn)化作用為例：轉(zhuǎn)化是微生物細(xì)胞直接吸收外源DNA的過(guò)程。①化學(xué)轉(zhuǎn)化法：在分子克隆中，宿主細(xì)胞需經(jīng)人工處理成能吸收重組DNA分子的敏感細(xì)胞才能用于轉(zhuǎn)化，這是細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。0℃的CaCl2低滲溶液中，細(xì)胞呈球形（感受態(tài)）；經(jīng)42℃短時(shí)間熱沖擊后，細(xì)胞可吸收外源DNA；在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)，球狀細(xì)胞復(fù)原，并分裂增殖；在選擇型平板上可選出轉(zhuǎn)化子。②電擊轉(zhuǎn)化法：除化學(xué)法轉(zhuǎn)化細(xì)菌外，還可采用高壓脈沖電擊轉(zhuǎn)化法。電擊法不需要預(yù)先誘導(dǎo)細(xì)菌的感受態(tài)，只是依靠短暫的電擊來(lái)促使DNA進(jìn)入細(xì)菌。7．在載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)中，簡(jiǎn)述顯色篩選法的基本原理答：顯色篩選法的基本原理：顯色篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，也可區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達(dá)產(chǎn)物能使細(xì)胞產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而易于辨認(rèn)和挑選，如大腸桿菌質(zhì)粒pUC18攜帶的lacZ’基因（藍(lán)色反應(yīng)）、鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702攜帶的melC基因（黑色反應(yīng)）等8.簡(jiǎn)述發(fā)酵工程的種子質(zhì)量控制有哪些主要因素。答：影響種子質(zhì)量因素：原材料質(zhì)量原材料質(zhì)量波動(dòng)引起種子質(zhì)量不穩(wěn)定波動(dòng)的主要原因無(wú)機(jī)離子含量不同（微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少也會(huì)影響孢子的質(zhì)量）培養(yǎng)溫度溫度過(guò)低，菌種生長(zhǎng)發(fā)育緩慢溫度過(guò)高會(huì)使菌絲過(guò)早自溶濕度濕度低，孢子生長(zhǎng)快濕度大孢子生長(zhǎng)慢通氣與攪拌足夠的通氣量，以報(bào)紙那個(gè)菌種代謝的正常，提高種子的質(zhì)量攪拌可提高通氣效果，促進(jìn)生長(zhǎng)繁殖，過(guò)度攪拌導(dǎo)致培養(yǎng)液大量涌泡，液膜表面的酶容易氧化變性，泡沫過(guò)多增加染菌機(jī)會(huì)，增加能耗。絲狀微生物不宜劇烈攪拌。斜面冷藏時(shí)間對(duì)孢子的生產(chǎn)能力有較大影響，冷藏時(shí)間越長(zhǎng)，生產(chǎn)能力下降越多。培養(yǎng)基有較完全和豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，糖分少，需充足的氮源和生長(zhǎng)因子，無(wú)機(jī)氮源比例大；各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度不必太高；供孢子用的種子培養(yǎng)基，可添加易被吸收用的碳源和氮源；應(yīng)考慮與發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分相近。pH原則是獲得最大比生長(zhǎng)速率和適當(dāng)?shù)木?；培養(yǎng)最后一級(jí)種子的培養(yǎng)基的pH應(yīng)接近于發(fā)酵培養(yǎng)基的pH，以便種子能盡快適應(yīng)新的環(huán)境。影響種子質(zhì)量的因素有哪些：1.培養(yǎng)基2.培養(yǎng)條件3.接種量4.孢子的質(zhì)量保證種子質(zhì)量措施：1.菌種穩(wěn)定性檢查2.無(wú)雜菌檢查9、種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求、一般步驟。答：目的：首先是出于接種量的需要與菌種的馴化，同時(shí)對(duì)于縮短發(fā)酵時(shí)間、保證生產(chǎn)水平也有幫助。要求：對(duì)于種子應(yīng)當(dāng)具備以下要求：總量及濃度能滿足要求。生理狀況穩(wěn)定，個(gè)體與群體區(qū)隔明顯。活力強(qiáng)，移種發(fā)酵后，能夠迅速生長(zhǎng)。無(wú)雜菌污染。種子擴(kuò)培的一般過(guò)程是：斜面菌種→一級(jí)種子培養(yǎng)（搖瓶）→二級(jí)種子培養(yǎng)(種子罐)→

發(fā)酵14簡(jiǎn)述總大腸桿菌檢測(cè)主要操作步驟

答：3.1檢樣稀釋

3.1.1以無(wú)菌操作將檢樣25mL(或g)放于有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)(瓶?jī)?nèi)予置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi),經(jīng)充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質(zhì)器,以8000-10000r/min的速度處理1min,做成1:10的均勻稀釋液。

3.1.2用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL,注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi),振搖試管混勻,做成1:100的稀釋液。

3.1.3另取1mL滅菌吸管,按上條操作依次做10倍遞增稀釋液,每遞增稀釋一次,換用1支1mL滅菌吸管。

3.1.4根據(jù)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì),選擇三個(gè)稀釋度,每個(gè)稀釋度,接種3管。

3.2乳糖發(fā)酵試驗(yàn)

將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi),接種量在1mL以上者,用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管,1mL及1mL以下者,用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種3管,置36±1℃溫箱內(nèi),培養(yǎng)24±2h,如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣,則可報(bào)告為大腸菌群陰性,如有產(chǎn)氣者,則按下列程序進(jìn)行。

3.3分離培養(yǎng)

將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上,置36±1℃溫箱內(nèi),培養(yǎng)18-24h,然后取出,觀察菌落形態(tài),并做革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。

3.4證實(shí)試驗(yàn)

在上述平板上,挑取可疑大腸菌群菌落1-2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色,同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管,置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h,觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽胞桿菌,即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。3.5報(bào)告根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的管數(shù),查MPN檢索表,報(bào)告每100mL(g)大腸菌群的MPN值。三.論述題1.微生物基因工程菌構(gòu)建的基本原理與過(guò)程答：基本原理：①DNA是遺傳物質(zhì)；②DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)；③中心法則和遺傳密碼；④基因是可以切割和轉(zhuǎn)移的。技術(shù)原理：①提供外源基因的劑量；②篩選、修飾重組基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件；③修飾構(gòu)建蛋白質(zhì)生物合成的翻譯調(diào)控元件；④基因工程菌的增殖及穩(wěn)定生產(chǎn)。過(guò)程：①目的基因的獲得；②DNA與載體體外連接；③導(dǎo)入受體細(xì)胞；④篩選、鑒定重組子；⑤目的基因的表達(dá)、檢測(cè)。4、發(fā)酵過(guò)程泡沫產(chǎn)生的原因有哪些？試述泡沫的控制途徑。答：1、通氣攪拌的強(qiáng)烈程度通氣大、攪拌強(qiáng)烈可使泡沫增多，因此在發(fā)酵前期由于培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分消耗少，培養(yǎng)基成分豐富，易起泡。應(yīng)先開(kāi)小通氣量，再逐步加大。攪拌轉(zhuǎn)速也如此。也可在基礎(chǔ)料中加入消泡劑。2、培養(yǎng)基配比與原料組成培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，黏度大，產(chǎn)生泡沫多而持久，前期難開(kāi)攪拌。3、菌種、種子質(zhì)量和接種量菌種質(zhì)量好，生長(zhǎng)速度快，可溶性氮源較快被利用，泡沫產(chǎn)生幾率也就少。菌種生長(zhǎng)慢的可以加大接種量4、滅菌質(zhì)量培養(yǎng)基滅菌質(zhì)量不好，糖氮被破壞，抑制微生物生長(zhǎng)，使種子菌絲自溶，產(chǎn)生大量泡沫，加消泡劑也無(wú)效。5、細(xì)胞破碎與沉淀技術(shù)有哪些？試述超聲波破碎原理。答：機(jī)械法：高壓勻漿破碎法，振蕩珠擊破碎法，高速攪拌珠研磨破碎法，超聲波破碎法。非機(jī)械法：滲透壓沖擊破碎法，凍融破碎法，酶溶破碎法，化學(xué)破碎法，去垢劑破碎法。超聲波破碎原理：將電能通過(guò)換能器轉(zhuǎn)換為聲能，這種能量通過(guò)液體介質(zhì)而變成一個(gè)個(gè)密集的小氣泡，這些小氣泡迅速炸裂，產(chǎn)生的象小炸彈一樣的能量，從而起到破碎細(xì)胞等物質(zhì)的作用。6