植物生理生化指標(biāo)測(cè)定(精)小黑豆相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定1.表型變化:鮮重、株高、主根長(zhǎng)和葉面積鮮重:取處理好的植株,擦干根和葉表面水分,測(cè)量整株植物的重量,每個(gè)測(cè)6個(gè)重復(fù)。株高:取處理好的植株,測(cè)量從根和莖分隔處到植株最高點(diǎn)的高度,記錄,每個(gè)測(cè)6個(gè)重復(fù)。主根長(zhǎng):取處理好的植株,測(cè)量從根和莖分隔處到主根最遠(yuǎn)點(diǎn)長(zhǎng)度,記錄,每個(gè)測(cè)6個(gè)重復(fù)。葉面積:取處理好的植株,選擇第二節(jié)段的葉片,測(cè)量葉面積,葉面積測(cè)量方法是測(cè)每個(gè)葉片最寬處長(zhǎng)度作為葉的長(zhǎng),測(cè)葉片最窄處長(zhǎng)度作為葉的寬,葉片長(zhǎng)和寬的乘積即為葉表面積。每個(gè)測(cè)6個(gè)重復(fù)。2.總蛋白、可溶性糖、丙二醛(MDA和H2O2含量測(cè)定樣品處理:取0.5g樣品(葉片要去除葉脈、根要先用清水清洗干凈,速在液氮中凍存,在遇冷的研缽中加液氮研磨,然后加入1.5ml的Tris-HCl(pH7.4抽提,將抽提液轉(zhuǎn)移到2ml的EP管中,于4℃,12000rpm離心15min,取上清,保存在-20℃下,上清液可用于總蛋白、丙二醛(MDA、可溶性糖和H2O2含量測(cè)定。總蛋白測(cè)定(Bradford法:樣品反應(yīng)體系(800ulH2O+200ulBradford+5ul樣品,空白對(duì)照為(800ulH2O+200ulBradford。測(cè)定后帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=32.549X-0.224(Y代表蛋白含量,X代表OD595,計(jì)算得出蛋白含量?？扇苄蕴菧y(cè)定:樣品反應(yīng)體系(1ml蒽酮+180ulddH2O+20ul樣品提取液;空白對(duì)照(1ml蒽酮+180ulddH2O,測(cè)定OD625后帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=0.0345X+0.0204(Y代表OD625,X代表可溶性糖含量(ug蒽酮配方:稱取100mg蒽酮溶于100ml稀硫酸(76ml濃硫酸+30mlH2O.注意:濃硫酸加入水中時(shí),一點(diǎn)一點(diǎn)遞加,小心濺出受傷。丙二醛(MDA測(cè)定:在酸性和高溫條件下,丙二醛可與硫代巴比妥(TBA反應(yīng)生成紅棕色的3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮,在532nm處有最大吸收波長(zhǎng),但該反應(yīng)受可溶性糖的極大干擾,糖與TBA的反應(yīng)產(chǎn)物在532nm處也有吸收,但其最大吸收波長(zhǎng)在450nm處。采用雙組分分光光度法,可計(jì)算出MDA含量。MDA的計(jì)算公式為:MDA(umol/L=6.45OD532-0.56OD450.反應(yīng)體系為:400ul0.6%TBA+350ulH2O+50ul樣品,80℃水浴10min后,測(cè)OD532和OD450。對(duì)照用Tris-HCl.0.6%TBA配方:稱取硫代巴比妥0.6g,溶于少量1MNaOH中,待其完全溶解后用10%TCA(稱取10gTCA三氯乙酸,溶于100ml蒸餾水中,待其溶解即可定容至100ml。H2O2測(cè)定(二甲酚橙法:樣品反應(yīng)體系(82ul溶液A+820ul溶液B(A:B=1:10+150ul樣品提取液,30℃水浴30min,測(cè)OD560。標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=0.01734X-0.0555(Y代表OD560,X代表H2O2含量溶液A(200ml:FeSO4.7H2O0.1835g;(NH42SO40.0872g;H2SO4(濃硫酸18M4.58ml,加水定容。溶液B(200ml:二甲酚橙0.0234g;山梨醇6g,加水定容到200ml3.可溶性蛋白、SOD、POD和CAT活性測(cè)定樣品處理:取0.5g樣品,速在液氮中凍存,在遇冷的研缽中加液氮研磨,然后加入1.5ml的Tris-HCl(pH7.0(內(nèi)含有20%甘油、1mmol/LASA(抗壞血酸、1mmol/LDTT(二硫蘇糖醇、1mmol/LEDTA、