血涂片制備與染色

【目的】掌握血涂片的制備和染色方法。

【原理】將一小滴血液均勻涂在玻片上，呈單層緊密分布，制成薄血片。用含天青B和伊紅的Romannowsky類(lèi)染料進(jìn)行染色。細(xì)胞中的堿性物質(zhì)如RBC中的血紅蛋白及嗜酸性粒細(xì)胞胞質(zhì)中的嗜酸性顆粒等與酸性染料伊紅結(jié)合染成紅色；細(xì)胞中的酸性物質(zhì)如淋巴細(xì)胞胞質(zhì)及嗜堿性粒細(xì)胞質(zhì)中的嗜堿性顆粒等與堿性染料亞甲藍(lán)結(jié)合染成藍(lán)色；中性粒細(xì)胞的中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍(lán)均可結(jié)合，染成淡紫紅色。實(shí)驗(yàn)用品器材:一次性采血針、消毒液、消毒棉簽、潔凈載玻片、推片試劑:Wright’s（瑞氏）染液【操作】1．采血

2．制作涂片

3．干燥涂片

4．標(biāo)記涂片

5．染色

6．觀(guān)察結(jié)果部位：WHO推薦中指或無(wú)名指尖內(nèi)側(cè)為宜，耳垂采血受溫度影響大；半歲以下拇指或足部，特殊人員視情況而定。采血步驟及注意事項(xiàng)：應(yīng)嚴(yán)格實(shí)行一人一針制；穿刺的深度的適當(dāng)，切忌用力擠壓，以免混入組織液，影響檢驗(yàn)結(jié)果。用消毒干棉球擦去第一滴血，以后流出的血液可以使用。皮膚采血法（毛細(xì)血管采血法）

涂片技術(shù)是制備血液樣品最常用的技術(shù)。將血液樣品制成單層細(xì)胞的涂片標(biāo)本，染色后可對(duì)血液中各種細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行形態(tài)觀(guān)察、細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞大小測(cè)量等工作。血涂片制備推片載玻片血液一張滿(mǎn)意的血涂片應(yīng)厚薄均勻頭體尾鮮明涂片干燥后用鉛筆在血涂片的頭部寫(xiě)上姓名和編號(hào)李四B123方法與步驟1：采血，擠出第二滴血置于載玻片的右側(cè)

2.再取另一張邊緣光滑的雙凹片，斜置于血滴的前緣，先向后稍移動(dòng)輕輕觸及血滴，使血液沿玻片端展開(kāi)成線(xiàn)狀。30~45°兩玻片的角度以30-45°為宜，輕輕將雙凹片向前勻速推進(jìn)，即涂成血液薄膜。3.成片，干燥一張滿(mǎn)意的血涂片應(yīng)厚薄均勻頭體尾鮮明李四[血涂片質(zhì)量評(píng)價(jià)]均勻、厚薄、頭體尾、邊緣、兩側(cè)注意：血滴大，速度快、角度大----血膜厚一張良好血涂片的標(biāo)準(zhǔn)是：厚薄適宜、頭體尾分明、細(xì)胞分布均勻、邊緣整齊、兩側(cè)及兩頭留有空隙，血膜長(zhǎng)度約4厘米。不良血涂片4.標(biāo)記涂片干燥后用鉛筆在血涂片的頭部寫(xiě)上姓名和編號(hào)李四1235.血涂片染色勿沖洗再加瑞氏染色Ⅱ液5-8滴后將Ⅰ液和Ⅱ液充分混勻靜置10分鐘直接流水沖洗至無(wú)浮色（切勿先倒掉染液）涂片經(jīng)水洗干燥后用油鏡分類(lèi)計(jì)數(shù)100個(gè)白細(xì)胞李四123涂片干燥后加瑞氏染色Ⅰ液5-8滴覆蓋整個(gè)血膜1分鐘[瑞氏染色原理]

細(xì)胞的染色既有物理的吸附作用，又有化學(xué)的親和作用，各種細(xì)胞成分化學(xué)性質(zhì)不同，對(duì)各種染料的親和力也不一樣。因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各種不同的色彩，例如血紅蛋白，嗜酸性顆粒為堿性蛋白質(zhì)，與酸性染料伊紅結(jié)果，染粉紅色，稱(chēng)為嗜酸性物質(zhì)；細(xì)胞核蛋白和淋巴細(xì)胞胞漿為酸性，與堿性染料美藍(lán)或天青結(jié)合，染紫藍(lán)色，稱(chēng)為嗜堿性物質(zhì)；中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍(lán)均可結(jié)合，染淡紫色，稱(chēng)為中性物質(zhì)。

圖

瑞氏染色原理示意圖

瑞氏-吉姆薩染色

【原理】

將瑞特染料和吉姆薩染料按一定比例混合后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，其染色原理同瑞特和吉姆薩染色法，但染色效果更佳，因?yàn)槠渚C合了瑞士和吉姆薩染色法的優(yōu)點(diǎn)?！痉椒▽W(xué)評(píng)價(jià)】

瑞氏染液和吉姆薩染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)有各自的顯色特征，前者對(duì)細(xì)胞質(zhì)和顆粒著色較好，后者對(duì)細(xì)胞核結(jié)構(gòu)顯示清晰。因此將二者結(jié)合，能取長(zhǎng)補(bǔ)短、集中優(yōu)勢(shì)，用該混合染液對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行染色，其細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)顆粒均著色鮮艷，對(duì)比鮮明。瑞氏-吉姆薩混合染色法是臨床上廣泛使用的方法。染色步驟A、待涂片在空氣中完全干燥后，滴加數(shù)滴Wright’s染液蓋滿(mǎn)血膜為止，染色1min。B、滴加等量或稍多的緩沖液，混勻，染色5-10分鐘。C、用流水沖去染液，吸水紙吸干，鏡檢?！举|(zhì)量控制】血膜要干透后才能染色，否則染色時(shí)易脫落.染色時(shí)間與染液濃度、室溫及細(xì)胞多少有關(guān)，一般染液淡、染色時(shí)間長(zhǎng)些效果好。染液不能過(guò)少，以防蒸發(fā)沉淀。沖洗時(shí)不能先倒掉染液，應(yīng)以流水沖，防止染料沉著。沖洗時(shí)間也不能長(zhǎng)。染色過(guò)淡，可復(fù)染。染色過(guò)深可用水沖洗或浸泡，還可用甲醇脫色?！救旧Y(jié)果評(píng)價(jià)】

正常情況：血膜外觀(guān)呈淡琥珀色。在顯微鏡下紅細(xì)胞染成粉紅色，在厚薄均勻處略有碟狀感。白細(xì)胞胞質(zhì)中的顆粒能顯示出各種細(xì)胞的特有色彩，細(xì)胞核染紫紅色，核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚。染色環(huán)境偏酸：則紅細(xì)胞和嗜酸性顆粒偏紅，白細(xì)胞核呈淺藍(lán)色或不著色，染色過(guò)酸pH<3.5時(shí)，則呈現(xiàn)一片紅色，白細(xì)胞中除嗜酸性顆粒外均不著色。染色環(huán)境偏堿：則所有細(xì)胞呈灰藍(lán)色，微偏堿者紅細(xì)胞暗紅、白細(xì)胞顆粒深暗。嗜酸性顆?？扇境砂岛稚踔梁谧仙蛩{(lán)色。中性顆粒也偏粗染成紫黑色，血膜過(guò)厚的地方呈綠色。染液不能過(guò)少，以防蒸發(fā)沉淀。染色過(guò)深可用水沖洗或浸泡，還可用甲醇脫色。染色情況(滿(mǎn)意、偏酸、偏堿）涂片干燥后加瑞氏染色Ⅰ液5-8滴覆蓋整個(gè)血膜1分鐘染色環(huán)境偏堿：則所有細(xì)胞呈灰藍(lán)色，微偏堿者紅細(xì)胞暗紅、白細(xì)胞顆粒深暗。核呈淡紫紅色?？床磺澹蕳U狀或分葉狀。涂片經(jīng)水洗干燥后用油鏡頭體尾鮮明各類(lèi)成熟白細(xì)胞的形態(tài)學(xué)：部位：WHO推薦中指或無(wú)名指尖內(nèi)側(cè)為宜，耳垂采C、用流水沖去染液，吸水紙吸干，鏡檢。瑞氏染液和吉姆薩染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)有各自的顯色特征，前者對(duì)細(xì)胞質(zhì)和顆粒著色較好，后者對(duì)細(xì)胞核結(jié)構(gòu)顯示清晰。用消毒干棉球擦去第一滴器材:一次性采血針、消毒液、消毒棉簽、潔凈載玻片、推片因此將二者結(jié)合，能取長(zhǎng)補(bǔ)短、集中優(yōu)勢(shì)，用該混合染液對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行染色，其細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)顆粒均著色鮮艷，對(duì)比鮮明。單核細(xì)胞（Mo）：在瑞氏染色涂片上為12～20μm，胞體圓形、橢圓形或不規(guī)則形；勿沖洗再加瑞氏染色Ⅱ液5-8滴后將Ⅰ液和Ⅱ液充分混勻靜置10分鐘嗜酸性粒細(xì)胞（Eo）：較中性粒細(xì)胞稍大，胞核多為兩葉，呈眼鏡、八字形，核染色質(zhì)粗糙染深紫紅色，胞漿內(nèi)充滿(mǎn)粗大均勻的嗜酸性顆粒，瑞氏染色時(shí)呈桔紅色，有折光性。用消毒干棉球擦去第一滴因此將二者結(jié)合，能取長(zhǎng)補(bǔ)短、集中優(yōu)勢(shì)，用該混合染液對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行染色，其細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)顆粒均著色鮮艷，對(duì)比鮮明。半歲以下拇指或足部，特殊人一張良好血涂片的標(biāo)準(zhǔn)是：厚薄適宜、頭體尾分瑞氏-吉姆薩混合染色法是臨床上廣泛使用的方法。器材:一次性采血針、消毒液、消毒棉簽、潔凈載玻片、推片白細(xì)胞胞質(zhì)中的顆粒能顯示出各種細(xì)胞的特有色彩，細(xì)胞核染紫紅色，核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚。明、細(xì)胞分布均勻、邊緣整齊、兩側(cè)及兩頭留有中性顆粒也偏粗染成紫黑色，血膜過(guò)厚的地方呈綠色。部位：WHO推薦中指或無(wú)名指尖內(nèi)側(cè)為宜，耳垂采采血步驟及注意事項(xiàng)：應(yīng)嚴(yán)格實(shí)行一人一針制；一張滿(mǎn)意的血涂片應(yīng)厚薄均勻6.血涂片的觀(guān)察低倍鏡觀(guān)察1.染色情況(滿(mǎn)意、偏酸、偏堿）2.細(xì)胞分布情況油鏡下分類(lèi)計(jì)數(shù)：體尾交界處。油鏡分類(lèi)時(shí)應(yīng)按一定走向，不要重復(fù)計(jì)數(shù)。（共計(jì)數(shù)100個(gè)白細(xì)胞）李四123體尾交界處理想?yún)^(qū)域

細(xì)胞重疊

細(xì)胞太稀理想?yún)^(qū)域各類(lèi)成熟白細(xì)胞的形態(tài)學(xué)：

中性粒細(xì)胞（Ne）：在瑞氏染色血涂片上呈圓形，直徑10～13μm，胞漿染粉紅色，核形一葉（桿狀核）至五葉不等，以三葉者多見(jiàn)，染成深紫紅色，胞漿中有許多細(xì)小均勻紫紅色顆粒。嗜酸性粒細(xì)胞（Eo）：較中性粒細(xì)胞稍大，胞核多為兩葉，呈眼鏡、八字形，核染色質(zhì)粗糙染深紫紅色，胞漿內(nèi)充滿(mǎn)粗大均勻的嗜酸性顆粒，瑞氏染色時(shí)呈桔紅色，有折光性。嗜堿性粒細(xì)胞（Ba）：胞漿中含有大小不等的嗜堿性顆粒，瑞氏染色時(shí)呈蘭黑色。于光學(xué)顯微鏡下常見(jiàn)胞漿中有小空泡，乃因嗜堿性顆粒易溶于水或因功能活動(dòng)而脫顆粒所致；核呈淡紫紅色?？床磺?，呈桿狀或分葉狀。淋巴細(xì)胞（Ly）：胞體呈圓形，直徑介于6～15μm之間，在成人血涂片中以小淋巴細(xì)胞為多見(jiàn)，直徑6～9μm，核大呈深紫色致密而濃染，胞漿量極少；大淋