PAGE1PAGE一、任務(wù)來源本國家標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)列入國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會2017年第三批國家標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃，項(xiàng)目編號“20171816-T-424”。該標(biāo)準(zhǔn)由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口，由清華大學(xué)等單位承擔(dān)該標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)。二、標(biāo)準(zhǔn)制定目的和意義微生物自發(fā)突變頻率狠低，正突變頻率更低，通過自然選育提高菌種生產(chǎn)能力、篩選高產(chǎn)菌株的效率較低，效果不明顯。因此在生產(chǎn)實(shí)踐中，以人工誘變基因突變?yōu)榛A(chǔ)的誘變育種是微生物育種的主要方法，尤其發(fā)酵工業(yè)中的各種優(yōu)良高產(chǎn)菌株絕大部分都是以誘變育種方法獲得的?；瘜W(xué)誘變和紫外誘變是傳統(tǒng)的誘變育種方法，應(yīng)用范圍廣，誘變效果顯著；ARTP誘變是新興的誘變方法，與化學(xué)誘變和紫外誘變相比更安全、高效。三種方法各有利弊，實(shí)際生產(chǎn)中往往需要結(jié)合不同的誘變方法，通過多輪誘變來獲得高性能的菌株。此標(biāo)準(zhǔn)編制旨在規(guī)范這三種誘變方式的實(shí)驗(yàn)方法，以更好的推動微生物誘變育種行業(yè)的發(fā)展。三、標(biāo)準(zhǔn)制訂原則和依據(jù)（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則本標(biāo)準(zhǔn)參考了其他同類國家標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容，同時充分考慮我國微生物誘變育種的使用經(jīng)驗(yàn)和要求。（二）標(biāo)準(zhǔn)制訂主要依據(jù)1、標(biāo)準(zhǔn)編寫遵循GB1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》的有關(guān)要求。2、標(biāo)準(zhǔn)編寫內(nèi)容參考我國與誘變相關(guān)的文件、標(biāo)準(zhǔn)，包括GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T27831-2011化學(xué)品遺傳毒性釀酒酵母菌基因突變試驗(yàn)方法GB/T21793-2008化學(xué)品體外哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗(yàn)方案四、標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容（一）標(biāo)準(zhǔn)適用范圍說明本標(biāo)準(zhǔn)方法屬于生物技術(shù)范疇，主要用于微生物化學(xué)、物理誘變育種。規(guī)定了微生物誘變育種的術(shù)語和定義、基本要求和操作步驟。本標(biāo)準(zhǔn)適用于紫外線、等離子體和化學(xué)誘變劑等誘變方法對微生物進(jìn)行誘變育種的實(shí)驗(yàn)操作流程。（二）內(nèi)容提要規(guī)定了紫外誘變、化學(xué)誘變和ARTP誘變的原理和適用范圍、誘變材料的準(zhǔn)備、誘變條件的選擇和操作步驟。五、主要工作過程2016年接到編制任務(wù)，開展資料收集和分析工作。研究了GB/T27831-2011《化學(xué)品遺傳毒性釀酒酵母菌基因突變試驗(yàn)方法》、GB/T21793-2008《化學(xué)品體外哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗(yàn)方案》了解了突變試驗(yàn)的相關(guān)要求，同時收集了紫外誘變、等離子體誘變、化學(xué)誘變期刊文章，總結(jié)各種誘變的操作規(guī)范。了解微生物誘變應(yīng)用范圍、處理?xiàng)l件基本情況。利用本課題組自主研發(fā)的常壓室溫等離子體誘變育種儀（ARTP）建立了等離子體誘變的操作方法，并誘變了大腸桿菌，得到了致死率隨ARTP照射時間的變化。為了使編制的標(biāo)準(zhǔn)能更好的適用微生物誘變育種應(yīng)用，同時有效地促進(jìn)誘變育種效率的提高，在2016年10月提出了標(biāo)準(zhǔn)討論提綱，確定了編制原則和主要內(nèi)容。該標(biāo)準(zhǔn)于2017年10月在全國標(biāo)準(zhǔn)信息公共服務(wù)平臺上進(jìn)行公示，于2019年2月召開專家會，聽取專家意見。六、方法驗(yàn)證及結(jié)果（一）紫外誘變粗狀假絲酵母1、供試菌株：粗狀假絲酵母(Candidavalida)14442、誘變條件：采用功率為20W紫外燈,照射距離為30cm,照射時間為0、2、4、6、8、10、12、14分鐘。3、操作步驟誘變處理時先打開紫外燈,預(yù)熱20min,以穩(wěn)定波長。取制好的菌懸液5ml于直徑為7cm的無菌培養(yǎng)皿中,內(nèi)加磁力轉(zhuǎn)子(無菌),在磁力攪拌下,開蓋用紫外光照射不同時間,每隔2min定時取出菌液,于冰浴中保存1h,同未經(jīng)紫外照射的菌液用無菌水進(jìn)行梯度稀釋,每個稀釋度做3個平行,涂布于普通固體平板,用黑色膠袋包好于30℃恒溫培養(yǎng)2d,觀察不同處理時間的平板菌落數(shù),計(jì)算致死率。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果出發(fā)菌株1444粗壯假絲酵母經(jīng)紫外線照射不同時間的致死曲線如圖1所示，照射6min時致死率達(dá)85%，可作為后續(xù)誘變的條件。圖1紫外誘變粗狀假絲酵母致死率曲線（二）化學(xué)誘變樹狀多節(jié)孢1、供試菌株：樹狀多節(jié)孢（NodulisporiumSylviforme）2、誘變條件：誘變劑選用亞硝基胍(NTG)，誘變劑濃度為0.5mg·mL-1、1.0mg·mL-1、2.0mg·mL-1、3.0mg·mL-1、4.0mg·mL-1、5.0mg·mL-1，誘變時間為10min、20min、30min，誘變溫度為26～28℃。3、實(shí)驗(yàn)步驟用丙酮試劑將亞硝基胍溶液配制成終濃度為0.5mg·mL-1、1.0mg·mL-1、2.0mg·mL-1、3.0mg·mL-1、4.0mg·mL-1、5.0mg·mL-1。取0.5mLNTG處理液與4.5mL稀釋的孢子懸液混合，置于直徑6cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，開啟磁力攪拌器，在26～28℃條件下分別處理10min、20min、30min后，用pH為8.0的磷酸緩沖溶液稀釋終止反應(yīng)，進(jìn)行10-1、10-2、10-3系列梯度稀釋。從每個稀釋度中取0.2mL/皿涂布于加有25～30mLPDA固體培養(yǎng)基平板上，28℃避光恒溫培養(yǎng)3～5d，計(jì)數(shù)各梯度平皿菌落數(shù)并計(jì)算致死率。每次試驗(yàn)測定結(jié)果都采用三個平行組，測試結(jié)果為各重復(fù)樣的平均值。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果本試驗(yàn)應(yīng)用不同濃度NTG對紫杉醇產(chǎn)生菌原生質(zhì)體懸液進(jìn)行處理，當(dāng)其濃度超過5.0mg·mL-1、處理15min時，紫杉醇產(chǎn)生菌HD1-3的孢子完全致死(致死率為100%)。因此，本試驗(yàn)選定NTG溶液濃度3.0mg·mL-1、處理20min作為適宜誘變劑量(致死率為74.6%±3.8%)（見表1）。表1不同NTG溶液濃度和處理時間下原生質(zhì)體致死率亞硝基胍濃度（mg·ml-1）時間（min）致死率（100%）0.51020.7±1.81528.5±1.72041.3±2.31.01032.6±2.71549.3±2.52053.8±3.22.01047.6±2.61556.8±3.72067.1±3.63.01069.2±4.11574.6±4.32076.3±3.84.01076.3±4.31588.4±4.62097.6±4.35.01096.4±5.21510020100（三）ARTP誘變1、供試菌株：大腸桿菌，2、誘變條件：功率設(shè)定在100W，氣流量設(shè)定在10slpm，輻照距離2mm。調(diào)整不同的處理時間：0s、30s、60s、120s、180s、240s、300s3、實(shí)驗(yàn)步驟用移液槍吸取10ul對數(shù)生長中期的菌液滴到無菌的小鐵片中央，再將鐵片置于帶蓋的無菌平皿中，每次用無菌鑷子取一片滴有誘變材料的鐵片置于常壓室溫等離子體下照射一定時間，每個樣品設(shè)三個重復(fù)。取相同的菌液作為陰性對照，陰性對照不照射等離子體。照射結(jié)束后，立即把照射過的小鐵片和陰性對照鐵片直接放入準(zhǔn)備好的預(yù)先加入1ml培養(yǎng)基的無菌EP管中，利用旋渦混合器，使菌株掉落到培養(yǎng)基中。這一過程相當(dāng)于菌液已經(jīng)被稀釋100倍了。處理完成后的材料和陰性對照稀釋到104cfu/ml、105cfu/ml、106cfu/ml（以誘變材料濃度為初始值計(jì)算稀釋倍數(shù)），吸取50～100μl涂布固體平板，培養(yǎng)至產(chǎn)生菌落，選擇每塊平板菌落數(shù)為102cfu數(shù)量級的平板計(jì)算菌落數(shù)，計(jì)算致死率。圖2ARTP誘變操作流程圖制備菌懸液（或孢子懸液）→制作菌物載片→ARTP處理→洗脫形成新的菌懸液→涂布→培養(yǎng)形成單菌落→液體培養(yǎng)篩選突變株4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，大腸桿菌用ARTP照射300s致死率為100%，240s致死率為99.3%，可以選擇240s可作為適宜的誘變劑量。表2大腸桿菌ARTP誘變致死率隨照射時間的變化照射時間（秒）菌落數(shù)（×108）致死率（%）08500.03055035.36024970.71203096.51801698.12406.299.33000.356100.0七、與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系本標(biāo)準(zhǔn)符合國家現(xiàn)行法律、法規(guī)、規(guī)章和強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)的要求。本標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施不涉及對現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的廢止情況。八、標(biāo)準(zhǔn)屬性的建議本標(biāo)準(zhǔn)為推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)。九、貫徹國家標(biāo)準(zhǔn)的要求