1基因擴增檢驗規(guī)范化與質(zhì)量監(jiān)管Q:為什么要進行質(zhì)量管理？A:因為差隨時都有可能發(fā)生，并且錯誤的結(jié)果比沒有結(jié)果更不可接受！2證據(jù)之一：EGFR突變檢測EQA結(jié)果3臨床PCR檢測常見問題假陽性假陰性一致化45多措并舉對策實驗室質(zhì)量保證的3+1模式檢測實驗室政府專家企業(yè)6內(nèi)容北京地區(qū)PCR技術(shù)審核規(guī)定（準入）北京地區(qū)PCR技術(shù)審核具體要求（準入）北京地區(qū)PCR技術(shù)準入后管理質(zhì)量指標監(jiān)測LDT探討7一、PCR技術(shù)審核規(guī)定8北京市PCR實驗室技術(shù)審核依據(jù)根據(jù)《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號）文件精神，結(jié)合北京市實際情況，制定本暫行規(guī)定。京衛(wèi)醫(yī)字〔2012〕160號9適用范圍第二條

《規(guī)定》適用于開展臨床基因擴增檢驗技術(shù)的醫(yī)療機構(gòu)實驗室。第三條開展與基因擴增技術(shù)相關(guān)的檢驗項目時，如分子病理、遺傳學(xué)等專業(yè)檢測項目，以及基于基因擴增技術(shù)的分子雜交、基因突變檢測、序列分析等技術(shù)可參照本規(guī)定執(zhí)行。同時，應(yīng)符合衛(wèi)生行政管理部門核準登記的相應(yīng)診療科目和有關(guān)診療規(guī)范的要求。10診療科目__醫(yī)學(xué)檢驗科臨床體液、血液專業(yè)臨床化學(xué)檢驗專業(yè)臨床免疫、血清學(xué)專業(yè)臨床微生物學(xué)專業(yè)臨床細胞分子遺傳學(xué)《醫(yī)療機構(gòu)臨床檢驗項目目錄（2013年版）》11質(zhì)量監(jiān)管第四條北京市衛(wèi)計委及各區(qū)衛(wèi)計委負責(zé)所轄行政區(qū)域內(nèi)醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室的備案和監(jiān)督管理工作。北京市衛(wèi)計委委托北京市醫(yī)學(xué)檢驗質(zhì)量控制和改進中心負責(zé)本市醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室的技術(shù)審核、培訓(xùn)和質(zhì)量管理等工作。第五條質(zhì)控中心根據(jù)工作需要組建相關(guān)專業(yè)專家?guī)臁?2第六條技術(shù)審核依據(jù)《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號）、北京市衛(wèi)生局《關(guān)于印發(fā)北京市醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室技術(shù)審核相關(guān)文件的通知》（京衛(wèi)醫(yī)字〔2012〕160號）13第七條技術(shù)審核工作流程（一）7.1申報：擬開展臨床基因擴增檢驗技術(shù)的醫(yī)療機構(gòu)，應(yīng)按照相關(guān)文件規(guī)定，向準予登記注冊的衛(wèi)生行政部門提交相關(guān)申請材料（在區(qū)衛(wèi)計委登記注冊的醫(yī)療機構(gòu)申請開展臨床基因擴增檢驗技術(shù)的，由區(qū)衛(wèi)計委初審合格后報市衛(wèi)生局），提交《北京市醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室技術(shù)驗收申請表》。147.2資料審核：由質(zhì)控中心組織專家?guī)斐蓡T對醫(yī)療機構(gòu)提供的申報材料進行初步審核。7.3現(xiàn)場驗收：經(jīng)初審合格的實驗室，組織專家進行現(xiàn)場核查。7.4整改：對于存在缺陷，需要整改的實驗室，可根據(jù)其存在缺陷的程度，限定10-30日完成實驗室整改，并提交整改報告，質(zhì)控中心組織專家進行復(fù)核。7.5審核結(jié)果：質(zhì)控中心組織專家會議，根據(jù)實驗室資料及現(xiàn)場驗收結(jié)果，出具技術(shù)審核報告。第七條技術(shù)審核工作流程（二）157.6登記備案：衛(wèi)生行政部門將經(jīng)審核合格、批準設(shè)置的臨床基因擴增檢驗實驗室進行登記備案.經(jīng)備案的臨床基因擴增檢驗實驗室可開展臨床基因擴增檢驗工作，向臨床出具檢驗報告。擬開展臨床分子生物學(xué)及細胞遺傳學(xué)檢驗診療科目下檢驗項目的醫(yī)療機構(gòu)，應(yīng)申請相關(guān)診療科目登記。7.7備案的臨床基因擴增檢驗實驗室參加醫(yī)療機構(gòu)的年度校驗。第七條技術(shù)審核工作流程（三）16第八條人員培訓(xùn)8.1北京市醫(yī)學(xué)檢驗質(zhì)量控制和改進中心對擬從事臨床基因擴增檢驗實驗室工作的人員進行相關(guān)業(yè)務(wù)培訓(xùn)。8.2質(zhì)控中心應(yīng)將培訓(xùn)時間、內(nèi)容、授課教師等備案，并定期對培訓(xùn)內(nèi)容及培訓(xùn)效果進行評估。8.3對參加培訓(xùn)且考試合格者，頒發(fā)臨床基因擴增檢驗實驗室技術(shù)培訓(xùn)證。17二、PCR技術(shù)審核具體要求18第一條人員實驗室技術(shù)人員:相關(guān)專業(yè)——大專以上學(xué)歷，或具有中級及以上技術(shù)職稱，有2年以上的實驗室工作經(jīng)歷基因檢驗相關(guān)培訓(xùn)證書醫(yī)療機構(gòu)的正式職工，或合同制聘用技術(shù)人員。實驗室應(yīng)有與所開展檢測項目及樣本量相適宜的工作人員，但不少于2人19人員實驗室須制定并執(zhí)行針對所有工作人員的培訓(xùn)計劃，為每個技術(shù)人員建立培訓(xùn)檔案，并考核培訓(xùn)效果。工作人員需參加檢驗項目相關(guān)的繼續(xù)教育。出據(jù)診斷性報告的實驗室應(yīng)有執(zhí)業(yè)醫(yī)師。實驗室技術(shù)負責(zé)人應(yīng)具有相關(guān)專業(yè)的學(xué)士或以上學(xué)位，并有5年以上的相關(guān)專業(yè)的工作經(jīng)歷。實驗室負責(zé)人應(yīng)具有相關(guān)專業(yè)高級技術(shù)職務(wù)任職資格。20第二條

實驗室環(huán)境、設(shè)施和設(shè)備實驗室空間和環(huán)境應(yīng)保證檢測設(shè)備和分析過程正常運行，不相互干擾。原則上，臨床基因擴增檢驗實驗室應(yīng)設(shè)置“試劑儲存和準備區(qū)”、“標本制備區(qū)”、“擴增區(qū)”和“擴增產(chǎn)物分析區(qū)”。實驗室工作環(huán)境符合生物安全要求。用于保存試劑和標本的冰箱或冰柜。應(yīng)配備與檢驗項目相適應(yīng)的儀器設(shè)備，如試劑準備區(qū)配備超凈臺，標本制備區(qū)配備二級生物安全柜。應(yīng)配備不間斷電源（UPS）或備用電源。若實驗室同時使用細胞/組織和血漿進行核酸擴增時，應(yīng)防范細胞/組織中的DNA對血漿游離DNA的污染。21第三條檢驗項目實驗室開展的檢驗項目應(yīng)符合衛(wèi)計委《醫(yī)療機構(gòu)臨床檢驗項目目錄》（2013年版）的要求。新項目需經(jīng)衛(wèi)生行政部門審批（備案）。所用試劑、儀器應(yīng)經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）批準。22第四條質(zhì)量控制實驗室應(yīng)有質(zhì)量控制程序，特別是試劑的質(zhì)量評估或驗證程序，包括檢測用的化學(xué)或生物試劑。做好人員培訓(xùn)和儀器校準、維護、維修。對所用試劑盒進行性能驗證，確保實驗室的檢測能力達到試劑盒說明書的要求。實驗室應(yīng)參加室間質(zhì)評活動。無室間質(zhì)評活動時，應(yīng)與有質(zhì)量保障的實驗室建立檢測結(jié)果室間比對計劃，每6個月至少進行1次比對。23人員能力評估

建立和執(zhí)行有關(guān)技術(shù)人員的能力評估程序，并做好記錄。至少每年對技術(shù)人員能力評估一次。能力評估至少包括以下內(nèi)容：檢測項目的操作情況，包括樣本準備、處理和檢測過程；實驗記錄、檢測結(jié)果解釋和檢測報告簽發(fā)；IQC和EQA結(jié)果的記錄、分析及失控后的糾正措施，等；儀器保養(yǎng)和功能檢查的操作；解決問題能力的綜合評估。24實驗室管理進行基因擴增檢驗操作的實驗室應(yīng)建立和完善防止核酸污染的措施。實驗室布局：應(yīng)符合《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)[2010]194號）附件的要求；個人防護：根據(jù)需要，配備實驗服和手套，防止交叉污染移液器：試劑配置、樣本制備、擴增產(chǎn)物分析應(yīng)分別配備移液器，并在相應(yīng)區(qū)域內(nèi)使用。應(yīng)使用活塞式移液器和帶濾芯吸頭。移液器應(yīng)定期清潔。生物樣本處理：宜在生物安全柜中進行。耗材質(zhì)檢：帶濾芯吸頭密封性如何；離心管是否含有核酸擴增抑制物，離心管密封性與離心耐受性如何。25質(zhì)量控制檢測患者樣本時，應(yīng)同時測定室內(nèi)質(zhì)控品，質(zhì)控品至少包括“弱陽性”/“低濃度”和“陰性”。參加室間質(zhì)評活動，或進行實驗室間結(jié)果比對。更換不同廠家的試劑時，應(yīng)進行性能驗證。26第五條檢測報告的內(nèi)容和格式實驗室檢測報告應(yīng)符合《醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室管理辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)［2006］73號）第十七條的要求，適用時，并考慮以下因素：對關(guān)鍵信息應(yīng)突出顯示，詳細描述；用于風(fēng)險評估計算的信息；免責(zé)聲明或?qū)z測局限性的說明。27第六條記錄管理紙質(zhì)紀錄：應(yīng)至少保存2年。包括：檢測記錄、IQC記錄、EQA記錄或比對記錄電子記錄：電子記錄應(yīng)有備份;計算機系統(tǒng)只限授權(quán)的人員使用;必須有電子記錄的追溯能力。28三、PCR技術(shù)準入后管理29質(zhì)量維持與改進（內(nèi)部）質(zhì)量體系建設(shè)與運行分析前標本質(zhì)量控制IQCEQA質(zhì)量監(jiān)測其他30質(zhì)量監(jiān)管（外部）校驗（年度）EQAIQC實時監(jiān)控盲樣飛行檢查持續(xù)培訓(xùn)（可個性化訂制培訓(xùn)內(nèi)容）與衛(wèi)生監(jiān)督部門聯(lián)合檢查與執(zhí)法31標本類型與要求全血標本：采集外周靜脈血2~3mL并置于采血管中，將采血管輕輕顛倒混勻數(shù)次以確保充分抗凝，避免溶血。細胞內(nèi)RNA：建議用含RNA穩(wěn)定劑的采樣管，或采樣后盡快將全血或骨髓加入到RNA穩(wěn)定溶液中。干血斑標本：可向無菌濾紙上滴加約50

L全血，根據(jù)需要可連續(xù)在數(shù)個印圈上滴加標本，于室溫自然干燥至少4小時。干血斑標本采集時不要堆疊血斑，不與其他界面接觸，待血斑充分干燥后應(yīng)放入無菌袋中，避免血斑之間的相互污染，同時加入干燥劑和濕度指示卡，密封包裝后運送。組織標本：新鮮組織、活檢組織、石蠟包埋組織和石蠟切片。新鮮組織樣本：理想的分子檢測標本類型。保存方法是手術(shù)切除后迅速（30分鐘內(nèi)）置于液氮中，然后保存于液氮罐或-80℃冰箱。若需要從大的新鮮組織樣本中提取核酸，要維持組織的水化。可用無菌生理鹽水浸濕的無菌紗布或濾紙包裹。石蠟包埋組織：推薦用10％中性緩沖甲醛溶液固定組織標本，避免使用含重金屬離子的固定液如Bouin液等。甲醛固定的石蠟包埋組織不適于用作RNA檢測。標本類型與要求標本容器的選擇根據(jù)不同檢測物的種類，選擇適合的容器：全血或骨髓標本：一般采用EDTA或枸櫞酸鹽抗凝的采集管，肝素對DNA擴增有抑制作用。RNA：無RNA酶的采集管，可含有RNA穩(wěn)定劑。DNA：提取后的DNA可在-70℃條件下至少保存7年以上。保存DNA的凍存管應(yīng)為疏水性塑料管，有螺口紋，以避免蒸發(fā)。需要注意的是，含聚丙烯的塑料管對DNA有吸附作用，特別是在高漲力離子條件下。與含聚丙烯的塑料管相比，聚乙烯的塑料管更易于DNA結(jié)合。保存時間（天數(shù)）紅色為Streck管，黑色為EDTA管胎兒游離DNA的比例cfDNA采集管：若使用EDTA抗凝采血管進行采集，顛倒混勻時應(yīng)動作輕柔，防止溶血；血漿和血細胞要盡快分離（6小時內(nèi)），防止白細胞裂解釋放出DNA污染游離DNA，血漿分離的時間最長不能超過24小時。Streck管可保存血標本7天而不影響游離DNA的濃度和DNA質(zhì)量，因其可穩(wěn)定白細胞不發(fā)生裂解。vandenBoomD,EhrichM.Optimizingbloodcollection,transportandstorageconditionsforcellfreeDNAincreasesaccesstoprenataltesting[J].ClinicalBiochemistry,2013,46:1099-1104.標本類型與要求樣本采集中的防污染樣本采集最好采用一次性材料，不用處理便可直接使用；采集中要戴手套、口罩，防止混入操作者的毛發(fā)、表皮細胞、痰液等。如使用玻璃器皿，必須經(jīng)高壓滅菌，以使可能存在的DNase失活；如提取RNA樣品，必須采用RNase抑制劑措施和無RNase材料。制備不同患者病理切片樣本時，需更換新刀片，并清除操作器皿上先前樣本的殘留。濾紙片上的干血斑：一個干血斑取材完畢后，穿孔機需用70％的乙醇徹底清洗，PBS沖洗后，方可用于下一個干血斑的采集。標本運輸實驗室應(yīng)建立詳細的樣本運送標準操作規(guī)程（SOP），對臨床醫(yī)生提供樣本采集手冊，要求物流人員填寫相關(guān)運送記錄表，確保運送過程中樣本的安全性和過程的可控性。運輸過程中，標本容器應(yīng)密閉，防止標本灑落，如放置血液標本的采血管應(yīng)用石蠟?zāi)せ蛲该髂z帶封住管蓋。標本運輸過程中選用輕質(zhì)且不易破碎的包裝物，并在包裝間隙用細碎輕質(zhì)材料填充。物流環(huán)節(jié)（含冷鏈運輸）應(yīng)有相關(guān)運送記錄，確保樣本運送安全、無污染、無降解。根據(jù)標本類型和分析物，選擇合適的運輸條件。在途時限不超過48小時。DNA可以在室溫（18?25℃）下運送，盡量在8h之內(nèi)到達。或者采用冰壺加冰或泡沫箱加冰密封進行運輸。RNA短時間內(nèi)的運送如10min左右，可室溫下運送，如為較長時間，則應(yīng)在加冰條件下運送，建議在4h送至實驗室。如條件允許，應(yīng)使用液氮或者保存在特殊試劑中運輸。組織或血液標本的采集過程中可能引起部分基因的表達上調(diào)，定量分析基因表達時需考慮到。標本運輸耳聾基因盲樣監(jiān)測EDTA抗凝的全血樣本。用微陣列芯片法和測序法對9個位點型別鑒定。緩慢將30uL全血點制到濾紙上，形成1個干血斑，并室溫干燥，避免陽光直射。將血斑打孔，包裝并貼簽。發(fā)放到相關(guān)實驗室，每家11個樣本。40政府主導(dǎo)的信息采集實驗室的基本情況進行調(diào)研檢驗質(zhì)控中心對北京地區(qū)臨床基因擴擴增檢驗實驗室的基本情況進行調(diào)研。共收到85家實驗室的回報結(jié)果。調(diào)研報告已上交至北京市衛(wèi)計委醫(yī)政醫(yī)管處。41學(xué)歷分布情況實驗室人員的學(xué)歷主要以本科生和研究生為主。相對于醫(yī)學(xué)檢驗實驗室，醫(yī)院實驗室高學(xué)歷人員所占比例較多。42工作年限分布情況實驗室人員的工作年限主要集中在10年以下。醫(yī)學(xué)檢驗實驗室和醫(yī)院實驗室人員的工作年主要集中在10年以下。在11~20年的工齡中，醫(yī)學(xué)實驗室人員的比重相對較多。43職稱分布情況實驗室人員的職稱主要為初中級。相對于醫(yī)學(xué)檢驗實驗室，醫(yī)院實驗室的中級職稱人員所占比例較多，未定級的實驗室人員較少。4445現(xiàn)場檢查與執(zhí)法為了進一步增強臨床基因擴增實驗室的監(jiān)管力度，北京市檢驗質(zhì)控中心與北京市衛(wèi)生監(jiān)督所聯(lián)合執(zhí)法，推動北京地區(qū)的臨床基因擴增檢驗實驗室依法執(zhí)業(yè)，規(guī)范作業(yè)。46四、質(zhì)量指標監(jiān)測47482017年北京臨床檢驗中心開始建立分子檢測質(zhì)量指標模型KEYPROCESSESSPECIFICQUALITYINDICATORS–PRIORITY1UnsuccessfulDNAextractionratePercentageof:Numberofonetimeunsuccessfullyextractedsamples/totalnumberofextractedsamples;unsuccessfulDNAextraction=extractedsampleswhichdonotpassinternalextractionQCUnsuccessfullibraryQCratePercentageof:NumberofonetimelibrariesdonotpassQC/totalnumberoflibrariesunsuccessfullibraries=librarieswhichdonotpassinternallibrarypreparationQCUnsuccessfulsequencingratePercentageof:Numberofsampleswithunsuccessfullyonetimelibrarysequenced/totalnumberofsequencingsamplesunsuccessfulSequencing=librarieswhichdonotpassinternalsequencingQCUnsuccessfuldateanalysisratePercentage