目次

前言..............................................................................................................................................i

1適用范圍.......................................................................................................................................1

2術(shù)語(yǔ)和定義...................................................................................................................................1

3方法原理.......................................................................................................................................1

4干擾和消除...................................................................................................................................1

5試劑和材料...................................................................................................................................1

6儀器和設(shè)備...................................................................................................................................2

7樣品...............................................................................................................................................3

8分析步驟.......................................................................................................................................3

9結(jié)果計(jì)算與表示...........................................................................................................................4

10精密度和準(zhǔn)確度.........................................................................................................................5

11質(zhì)量保證和質(zhì)量控制.................................................................................................................5

12廢物處理.....................................................................................................................................6

附錄A（資料性附錄）最大可能數(shù)（MPN）表........................................................................7

i

前言

為貫徹《中華人民共和國(guó)環(huán)境保護(hù)法》和《中華人民共和國(guó)水污染防治法》，保護(hù)環(huán)境，

保障人體健康，規(guī)范水中糞大腸菌群的測(cè)定方法，制定本標(biāo)準(zhǔn)。

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測(cè)定地表水、地下水和廢水中糞大腸菌群的多管發(fā)酵法。

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為資料性附錄。

本標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)《水質(zhì)糞大腸菌群的測(cè)定多管發(fā)酵法和濾膜法（試行）》（HJ/T347-2007）

多管發(fā)酵法部分的修訂，與原標(biāo)準(zhǔn)相比主要修改內(nèi)容如下：

在干擾與消除、水樣、分析步驟、結(jié)果計(jì)算與表示、精密度和準(zhǔn)確度、質(zhì)量控制和質(zhì)量

保證等方面做了具體的要求。

本標(biāo)準(zhǔn)首次發(fā)布于2007年，原標(biāo)準(zhǔn)起草單位為中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站等單位。本次為第一次

修訂。

自本標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施之日起，《水質(zhì)糞大腸菌群的測(cè)定多管發(fā)酵法和濾膜法（試行）》（HJ/T

347-2007）廢止。

本標(biāo)準(zhǔn)由環(huán)境保護(hù)部環(huán)境監(jiān)測(cè)司、科技標(biāo)準(zhǔn)司組織制修訂。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：遼寧省環(huán)境監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)中心。

本標(biāo)準(zhǔn)的驗(yàn)證單位：大連市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、丹東市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站、錦州市環(huán)境監(jiān)測(cè)中

心站、遼陽(yáng)市環(huán)境監(jiān)測(cè)站、沈陽(yáng)市疾病預(yù)防控制中心、遼寧北方環(huán)境檢測(cè)技術(shù)有限公司。

本標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境保護(hù)部20□□年□□月□□日批準(zhǔn)。

本標(biāo)準(zhǔn)自20□□年□□月□□日起實(shí)施。

本標(biāo)準(zhǔn)由環(huán)境保護(hù)部解釋。

i

水質(zhì)糞大腸菌群的測(cè)定多管發(fā)酵法

1適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測(cè)定水中糞大腸菌群的多管發(fā)酵法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于地表水、地下水和廢水中糞大腸菌群的測(cè)定。

本方法的檢出限：12管法為3MPN/L，適用于清潔的水樣；15管法為20MPN/L，適用

于受到不同程度污染的水樣。

2術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

2.1

糞大腸菌群fecalcoliforms

又稱(chēng)耐熱大腸菌群。44.5℃培養(yǎng)24h，能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰

性無(wú)芽孢桿菌，是總大腸菌群的一部分。

2.2

最大可能數(shù)mostprobablenumber,MPN

微生物檢驗(yàn)常用發(fā)酵法，又稱(chēng)稀釋法，是一種利用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理定量檢測(cè)微生物濃度的方

法。它根據(jù)不同稀釋度一定體積水樣中被檢微生物存在與否的頻率，查表求得水樣中微生物

的濃度，與直接報(bào)告菌落數(shù)的平板計(jì)數(shù)法不同，它最終報(bào)告的是水樣中最有可能存在的目標(biāo)

微生物濃度，這個(gè)以最大可能存在的濃度，就被稱(chēng)為最大可能數(shù)（mostprobablenumber，縮

寫(xiě)為MPN）。

3方法原理

將一定量的水樣，以無(wú)菌操作方式接種到含有乳糖培養(yǎng)基的試管中，在特定的溫度

（44.5℃）培養(yǎng)24h，當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖時(shí)，產(chǎn)酸使培養(yǎng)液pH值降低，溴甲酚紫由紫色變?yōu)辄S

色，指示產(chǎn)酸；脫氫酶分解底物產(chǎn)生氣體，利用倒管指示產(chǎn)氣。通過(guò)指示劑的顏色變化和倒

管中有無(wú)氣體判斷是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣，從而確定是否存在糞大腸菌群，并通過(guò)查MPN表，以MPN

表示糞大腸菌群濃度值。

4干擾和消除

氯具有氧化性，較高濃度的重金屬離子具有毒性，它們都能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)酶的活性，

最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。可分別加入硫代硫酸鈉和乙二胺四乙酸二鈉排除氯或重金屬的干擾。

5試劑和材料

除非另有說(shuō)明，分析時(shí)均使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純化學(xué)試劑。

1

5.1乳糖蛋白胨培養(yǎng)液

成分：

蛋白胨10g

牛肉浸膏3g

乳糖5g

氯化鈉5g

1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml

制法：將蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化鈉加熱溶解于1000ml蒸餾水或去離子水中，調(diào)

節(jié)pH值到7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混勻，分裝于含有倒置小玻璃

管的試管中，115℃高壓蒸汽滅菌20min，儲(chǔ)存于冷暗處備用。

乳糖蛋白胨培養(yǎng)液可選用市售成品培養(yǎng)基。

5.2三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：按上述配方比例三倍（除蒸餾水或去離子水外），配成三倍乳

糖蛋白胨培養(yǎng)液，制法同上。

5.3EC培養(yǎng)液成分：

胰胨20g

乳糖5g

膽鹽三號(hào)1.5g

磷酸氫二鉀（K2HPO4）4g

磷酸二氫鉀（KH2PO4）1.5g

氯化鈉5g

制法：將上述成分或含有上述成分的市售成品加熱溶解于1000ml蒸餾水或去離子水中，

然后分裝于有玻璃倒管的試管中，115℃高壓蒸汽滅菌20min，滅菌后pH值應(yīng)為6.9。

5.4無(wú)菌水：新制備的蒸餾水或去離子水經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min，備用。

5.5硫代硫酸鈉（Na2S2O3?5H2O）。

5.6乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2O8Na2?2H2O）。

5.7硫代硫酸鈉溶液：ρ（Na2S2O3?5H2O）=0.10g/ml

稱(chēng)取硫代硫酸鈉10g，溶于適量蒸餾水或去離子水，定容至100ml，現(xiàn)配。

5.8乙二胺四乙酸二鈉溶液：ρ（C10H14N2O8Na2?2H2O）=0.15g/ml

稱(chēng)取乙二胺四乙酸二鈉15g，溶于適量蒸餾水或去離子水中，定容至100ml，此溶液保

質(zhì)期為30d。

6儀器和設(shè)備

6.1采樣瓶：500ml帶螺旋帽或磨口塞的廣口玻璃瓶。

6.2高壓蒸汽滅菌器：121℃、101.3kpa。

6.3隔水式恒溫培養(yǎng)箱：溫度偏差±0.5℃。

6.4pH計(jì)：準(zhǔn)確到0.1pH單位。

6.5接種環(huán)：直徑3mm。

6.6一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。

2

注：玻璃器皿及采樣器具試驗(yàn)前要按無(wú)菌操作要求包扎，121℃高壓蒸汽滅菌20min備用。

7樣品

7.1樣品采集

與其他項(xiàng)目一同采樣時(shí)，先單獨(dú)采集微生物水樣。采樣瓶不得用水樣沖洗，按無(wú)菌操作

要求采集水樣于滅菌的采樣瓶中。清潔水的采樣量不低于400ml，其余水體采樣量不低于100

ml。瓶?jī)?nèi)須留下足夠的空間，用以搖勻水樣。

采集江、河、湖、庫(kù)等地表水水樣時(shí)，可握住瓶子下部直接將帶塞采樣瓶插入水中，距

水面10～15cm處，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使水樣灌入瓶?jī)?nèi)然后蓋上瓶塞，將采樣瓶從水

中取出。如果沒(méi)有水流，可握住瓶子水平前推。水樣采好后，迅速扎上無(wú)菌包裝紙。

從水龍頭采集樣品時(shí)，不要選用漏水的龍頭，采水前可先將水龍頭打開(kāi)至最大，放水3～

5min，然后將水龍頭關(guān)閉，用火焰灼燒約3min滅菌，開(kāi)足龍頭，再放水1min，以充分除去

水管中的滯留雜質(zhì)。采樣時(shí)控制水流速度，小心接入瓶?jī)?nèi)。

采集地表水、廢水樣品及一定深度的水樣時(shí)，可使用滅菌過(guò)的專(zhuān)用采樣裝置采樣。

在同一采樣點(diǎn)進(jìn)行分層采樣時(shí)，應(yīng)自上而下進(jìn)行，以免不同層次的攪擾。

如果采集的是含有余氯或經(jīng)過(guò)加氯處理的水樣，需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液

（5.7），以除去余氯對(duì)細(xì)菌的抑制作用（每125ml容積加入0.1ml的硫代硫酸鈉溶液）；如果

采集的是重金屬離子含量較高的水樣，則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（5.8），

以消除干擾（每125ml容積加入0.3ml的乙二胺四乙酸二鈉溶液）。

注：10mg硫代硫酸鈉可保證去除水樣中1.5mg余氯，硫代硫酸鈉用量可根據(jù)水樣實(shí)際余氯量調(diào)整。

7.2樣品保存

采樣后2h內(nèi)檢測(cè)，否則，需10℃以下冷藏并不得超過(guò)6h。實(shí)驗(yàn)室接樣后，不能立即開(kāi)

展檢測(cè)的，應(yīng)將樣品放入0～4℃冰箱并2h內(nèi)測(cè)定。

8分析步驟

8.1樣品稀釋

當(dāng)接種水樣量為10ml或1ml時(shí)，充分混勻后備用。

當(dāng)接種水樣量小于1ml時(shí)，水樣應(yīng)制成稀釋樣品后使用。接種量為0.1ml、0.01ml時(shí)，

分別制成1:10稀釋樣品、1:100稀釋樣品。其他接種量的稀釋樣品依次類(lèi)推。

1:10稀釋樣品的制作方法為：吸取10ml水樣，注入盛有90ml無(wú)菌水的試管中，混勻，

制成1:10稀釋樣品。其他稀釋度的稀釋水樣同法制作。

8.2接種

將水樣充分混勻后，對(duì)于清潔的水樣，在2支裝有已滅菌的50ml三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液

的大試管中（內(nèi)有倒管），以無(wú)菌操作各加入水樣100ml，在10支裝有已滅菌的5ml三倍乳

糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中（內(nèi)有倒管），以無(wú)菌操作各加入水樣10ml，共計(jì)12管兩個(gè)稀釋度。

對(duì)于較清潔水樣，接種量為10ml、1ml、0.1ml；對(duì)于受到污染的水樣，接種量為1ml、0.1ml、

3

0.01ml或0.1ml、0.01ml、0.001ml等，共計(jì)15管三個(gè)稀釋度，水樣接種量參考表見(jiàn)表1。

表1水樣接種量參考表

接種量（ml）

水樣種類(lèi)

1010.110-210-310-410-510-6

湖水、水源水▲▲▲

河水▲▲▲

生活污水▲▲▲

醫(yī)療機(jī)構(gòu)排放污水（處理后）▲▲▲

畜禽養(yǎng)殖業(yè)等排放廢水▲▲▲

8.3初發(fā)酵試驗(yàn)

將已充分混勻的水樣以無(wú)菌操作分別接種到盛有乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中，在

37±0.5℃下培養(yǎng)24±2h。

產(chǎn)酸和產(chǎn)氣的試管表明試驗(yàn)陽(yáng)性。如在倒管內(nèi)產(chǎn)氣不明顯，可輕拍試管，有小氣泡升起

的為陽(yáng)性。

8.4復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)

輕微振蕩在初發(fā)酵試驗(yàn)中顯示為試驗(yàn)陽(yáng)性的試管，用接種環(huán)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到EC培養(yǎng)液

中。在（44.5±0.5）℃下培養(yǎng)24±2h。接種后所有試管必須在30min內(nèi)放進(jìn)培養(yǎng)箱中。

培養(yǎng)后立即觀察，倒管中產(chǎn)氣證實(shí)為糞大腸菌群陽(yáng)性。

9結(jié)果計(jì)算與表示

9.1結(jié)果計(jì)算

根據(jù)不同接種量的陽(yáng)性發(fā)酵管數(shù)量，查表A.1或表A.2（參見(jiàn)附錄A）。接種12份水樣時(shí)，

查表A.1可得每升糞大腸菌群MPN值。接種15份水樣時(shí)，查表A.2得到MPN值，再經(jīng)公式

（1）換算成每升水樣中糞大腸菌群MPN值。

C=10×M×f（1）

式中：C——每升水樣中糞大腸菌群MPN值，MPN/L；

10——將MPN值的單位MPN/100ml轉(zhuǎn)換為MPN/L；

M——查表得到的MPN值，MPN/100ml；

f——水樣稀釋倍數(shù)。

9.2結(jié)果表示

測(cè)定結(jié)果保留兩位有效數(shù)字，大于等于100時(shí)以科學(xué)計(jì)數(shù)法表示，結(jié)果的單位為MPN/L。

平均值以幾何平均計(jì)算。

4

10精密度和準(zhǔn)確度

10.1精密度

6個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)低濃度（約50MPN/L）、中濃度（約5.0×104MPN/L）和高濃度（約3.5×107

MPN/L）三個(gè)不同濃度糞大腸菌群的實(shí)際水樣和有證標(biāo)準(zhǔn)樣品（濃度為3670MPN/L，可接受

范圍為330～7710MPN/L）進(jìn)行了測(cè)定，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為2.3%～3.8%，

2.0%～11%，1.1%～5.4%和5.1%～17%；實(shí)驗(yàn)室間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.4%，11%，1.6%和

5.4%；實(shí)驗(yàn)室間95%置信區(qū)間見(jiàn)表2。

表2實(shí)驗(yàn)室間95%置信區(qū)間

低濃度（MPN/L）中濃度（MPN/L）高濃度（MPN/L）有證標(biāo)準(zhǔn)樣品（MPN/L）

置信區(qū)置信區(qū)置信區(qū)置信區(qū)

均值95%均值95%均值95%均值95%

間間間間

9.6×103～2.2×107～2413～

5447～622.7×1042.8×1073725

7.9×1043.6×1075751

10.2準(zhǔn)確度

6家實(shí)驗(yàn)室對(duì)糞大腸菌群有證標(biāo)準(zhǔn)樣品（濃度為3670MPN/L，可接受范圍為370MPN/L～

7710MPN/L）進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對(duì)誤差范圍為-6.2%～8.4%；相對(duì)誤差最終值為

-1.7%±11%。

注：微生物檢測(cè)數(shù)據(jù)為偏態(tài)分布，其測(cè)定結(jié)果全部經(jīng)以10為底對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行計(jì)算。

11質(zhì)量保證和質(zhì)量控制

11.1培養(yǎng)基檢驗(yàn)

更換不同批次培養(yǎng)基時(shí)要進(jìn)行陽(yáng)性和陰性菌株檢驗(yàn)，以確保其符合要求。

11.2培養(yǎng)基保存

配制好的培養(yǎng)基不宜保存過(guò)久，以少量勤配為宜。存放時(shí)應(yīng)避免陽(yáng)光直射，并且要避免

雜菌侵入和水分蒸發(fā)。當(dāng)培養(yǎng)液顏色變化，或體積變化明顯時(shí)廢棄不用。

11.3空白試驗(yàn)

每次試驗(yàn)都要用無(wú)菌水做實(shí)驗(yàn)室空白測(cè)定，培養(yǎng)后的試管中不得有任何顏色反應(yīng)。否則，

該次樣品測(cè)定結(jié)果無(wú)效，應(yīng)查明原因后重新測(cè)定。

11.4陽(yáng)性及陰性對(duì)照

糞大腸菌群測(cè)定的陽(yáng)性菌株（如大腸埃希氏菌Escherichiacoli），陰性菌株（如產(chǎn)氣腸桿

菌Enterobacteraerogenes）。將標(biāo)準(zhǔn)菌株配成濃度為300～3000個(gè)/ml的菌懸液，分別取相應(yīng)

水量的菌懸液按“8.2接種”要求接種于試管中，然后按“8.3初發(fā)酵試驗(yàn)”和“8.4復(fù)發(fā)

5

酵實(shí)驗(yàn)”要求培養(yǎng)，陽(yáng)性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，陰性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。否則，該次樣品

測(cè)定結(jié)果無(wú)效，應(yīng)查明原因后重新測(cè)定。

12廢物處理

使用后的器皿及廢棄物須經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min后，器皿方可清洗，廢棄物作為

一般廢物處置。

6

附錄A

（資料性附錄）

最大可能數(shù)（MPN）表

表A.112管法最大可能數(shù)（MPN）表

100ml水量的陽(yáng)性瓶數(shù)

10ml水量的陽(yáng)性管數(shù)012

1L水樣中糞大腸菌群數(shù)1L水樣中糞大腸菌群數(shù)1L水樣中糞大腸菌群數(shù)

0＜3411

13818

271327

3111838

4142452

5183070

6223692

72743120

83151161

93660230

104069＞230

注：接種2份100ml水樣，10份10ml水樣，總量300ml。

表A.215管法最大可能數(shù)（MPN）表

各接種量陽(yáng)性份數(shù)95%置信限各接種量陽(yáng)性份數(shù)95%置信限

MPN/100mlMPN/100ml

10ml1ml0.1ml下限上限10ml1ml0.1ml下限上限

000＜23008119

0012＜0.5730111225

0024＜0.5730213331

003530316

004730420

005930523

0102＜0.5731011225

0114＜0.51131114434

0126＜0.51531217546

013731320660

014931423

0151131527

0204＜0.51132014434

7

續(xù)表

各接種量陽(yáng)性份數(shù)95%置信限各接種量陽(yáng)性份數(shù)95%置信限

MPN/100mlMPN/100ml

10ml1ml0.1ml下限上限10ml1ml0.1ml下限上限

0216＜0.51532117546

022732220660

023932324

0241132427

0251332531

0306＜0.51533017546

031733121763

032933224

0331133328

0341333432

0351533536

040834021763

041934124872

0421134228

0431334332

0441534436

0451734540

050935025875

0511135129

0521335232

0531535337

0541735441

0551935545

1002＜0.5740013331

1014＜0.51140117546

1026＜0.51540221763

103811940325875

1041040430

1051240536

1104＜0.51141017546

1116＜0.51541121763

112811941226978

1131041331

1141241436

1151441542

1206＜0.51542022767

121811942126978

12210223422321191

8

續(xù)表

各接種量陽(yáng)性份數(shù)95%置信限各接種量陽(yáng)性份數(shù)95%置信限

MPN/100mlMPN/100ml

10ml1ml0.1ml下限上限10ml1ml0.1ml下限上限

1231242338

1241542444

1251742550

130811943027980

13110223431331193

132124323913110

1331543345

1341743452

1351943559

14011225440341293

141134414014110

1421544247

1431744354

1441944462

1452244569

150134504116120

1511545148

1521745256

1531945364

1542245472

1552445581

2005＜0.51350023770

2017117501311189

20292215024315110

203123285035819140

204145047624180

2051650595

2107117510331193

21192215114616120

212123285126321150

213145138426200

21417514110

21519515130

22092215204917130

221123285217023170

222144345229428220

2231752312033280

2241952415038370

9

續(xù)表

各接種量陽(yáng)性份數(shù)置信限各接種量陽(yáng)性份數(shù)置信限

MPN/10095%95%

MPN/100ml

10ml1ml0.1mlml下限上限10ml1ml0.1ml下限上限

2252252518044520

230123285307925190

2311443453111031250

2321753214037340

2332053318044500

2342253421053670

2352553525077790

2401543754013035300

2411754117043490

2422054222057700

2432354328090850

244255443501201000

245285454301501200

2501755024068750

251205513501201000

252235525401801400

253265539203003200

2542955416006405800

25532555≥2400800

注1：接種5份10ml水樣、5份1ml水樣、5份0.1ml水樣。

注2：如果有超過(guò)三個(gè)的稀釋度用于檢驗(yàn)，在一系列的十進(jìn)稀釋當(dāng)中，計(jì)算MPN時(shí)，只需要用其中依次

三個(gè)的稀釋度，取其陽(yáng)性組合。選擇的標(biāo)準(zhǔn)是：先選出5支試管全部為陽(yáng)性的最大稀釋(小于它的稀釋度也全

部為陽(yáng)性試管)，然后再加上依次相連的兩個(gè)更高的稀釋。用這三個(gè)稀釋度的結(jié)果數(shù)據(jù)來(lái)計(jì)算MPN值。

10

中華人民共和國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)

HJ□□□-201□

部分代替HJ/T347-2007

水質(zhì)糞大腸菌群的測(cè)定多管發(fā)酵法

Waterquality-Determinationoffecalcoliform-

Manifoldzymotechnics

（征求意見(jiàn)稿）

水質(zhì)糞大腸菌群的測(cè)定多管發(fā)酵法

1適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測(cè)定水中糞大腸菌群的多管發(fā)酵法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于地表水、地下水和廢水中糞大腸菌群的測(cè)定。

本方法的檢出限：12管法為3MPN/L，適用于清潔的水樣；15管法為20MPN/L，適用

于受到不同程度污染的水樣。

2術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

2.1

糞大腸菌群fecalcoliforms

又稱(chēng)耐熱大腸菌群。44.5℃培養(yǎng)24h，能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰

性無(wú)芽孢桿菌，是總大腸菌群的一部分。

2.2

最大可能數(shù)mostprobablenumber,MPN

微生物檢驗(yàn)常用發(fā)酵法，又稱(chēng)稀釋法，是一種利用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理定量檢測(cè)微生物濃度的方

法。它根據(jù)不同稀釋度一定體積水樣中被檢微生物存在與否的頻率，查表求得水樣中微生物

的濃度，與直接報(bào)告菌落數(shù)的平板計(jì)數(shù)法不同，它最終報(bào)告的是水樣中最有可能存在的目標(biāo)

微生物濃度，這個(gè)以最大可能存在的濃度，就被稱(chēng)為最大可能數(shù)（mostprobablenumber，縮

寫(xiě)為MPN）。

3方法原理

將一定量的水樣，以無(wú)菌操作方式接種到含有乳糖培養(yǎng)基的試管中，在特定的溫度

（44.5℃）培養(yǎng)24h，當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖時(shí)，產(chǎn)酸使培養(yǎng)液pH值降低，溴甲酚紫由紫色變?yōu)辄S

色，指示產(chǎn)酸；脫氫酶分解底物產(chǎn)生氣體，利用倒管指示產(chǎn)氣。通過(guò)指示劑的顏色變化和倒

管中有無(wú)氣體判斷是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣，從而確定是否存在糞大腸菌群，并通過(guò)查MPN表，以MPN

表示糞大腸菌群濃度值。

4干擾和消除

氯具有氧化性，較高濃度的重金屬離子具有毒性，它們都能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)酶的活性，

最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡?？煞謩e加入硫代硫酸鈉和乙二胺四乙酸二鈉排除氯或重金屬的干擾。

5試劑和材料

除非另有說(shuō)明，分析時(shí)均使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純化學(xué)試劑。

1

5.1乳糖蛋白胨培養(yǎng)液

成分：

蛋白胨10g

牛肉浸膏3g

乳糖5g

氯化鈉5g

1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml

制法：將蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化鈉加熱溶解于1000ml蒸餾水或去離子水中，調(diào)

節(jié)pH值到7.2～7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混勻，分裝于含有倒置小玻璃

管的試管中，115℃高壓蒸汽滅菌20min，儲(chǔ)存于冷暗處備用。

乳糖蛋白胨培養(yǎng)液可選用市售成品培養(yǎng)基。

5.2三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：按上述配方比例三倍（除蒸餾水或去離子水外），配成三倍乳

糖蛋白胨培養(yǎng)液，制法同上。

5.3EC培養(yǎng)液成分：

胰胨20g

乳糖5g

膽鹽三號(hào)1.5g

磷酸氫二鉀（K2HPO4）4g

磷酸二氫鉀（KH2PO4）1.5g

氯化鈉5g

制法：將上述成分或含有上述成分的市售成品加熱溶解于1000ml蒸餾水或去離子水中，

然后分裝于有玻璃倒管的試管中，115℃高壓蒸汽滅菌20min，滅菌后pH值應(yīng)為6.9。

5.4無(wú)菌水：新制備的蒸餾水或去離子水經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min，備用。

5.5硫代硫酸鈉（Na2S2O3?5H2O）。

5.6乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2O8Na2?2H2O）。

5.7硫代硫酸鈉溶液：ρ（Na2S2O3?5H2O）=0.10g/ml

稱(chēng)取硫代硫酸鈉10g，溶于適量蒸餾水或去離子水，定容至100ml，現(xiàn)配。

5.8乙二胺四乙酸二鈉溶液：ρ（C10H14N2O8Na2?2H2O）=0.15g/ml

稱(chēng)取乙二胺四乙酸二鈉15g，溶于適量蒸餾水或去離子水中，定容至100ml，此溶液保

質(zhì)期為30d。

6儀器和設(shè)備

6.1采樣瓶：500ml帶螺旋帽或磨口塞的廣口玻璃瓶。

6.2高壓蒸汽滅菌器：121℃、101.3kpa。

6.3隔水式恒溫培養(yǎng)箱：溫度偏差±0.5℃。

6.4pH計(jì)：準(zhǔn)確到0.1pH單位。

6.5接種環(huán)：直徑3mm。

6.6一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。

2

注：玻璃器皿及采樣器具試驗(yàn)前要按無(wú)菌操作要求包扎，121℃高壓蒸汽滅菌20min備用。

7樣品

7.1樣品采集

與其他項(xiàng)目一同采樣時(shí)，先單獨(dú)采集微生物水樣。采樣瓶不得用水樣沖洗，按無(wú)菌操作

要求采集水樣于滅菌的采樣瓶中。清潔水的采樣量不低于400