2

3.細(xì)胞工程本章學(xué)習(xí)目的：學(xué)習(xí)植物組織培養(yǎng)、原生質(zhì)體的制備和培養(yǎng)的原理和基本方法；掌握植物單倍體植株的概念和在生產(chǎn)實(shí)踐中的意義；了解植物代謝產(chǎn)物的概況和影響其工業(yè)化生產(chǎn)的主要因素；認(rèn)識動物細(xì)胞融合的基本方法及其在單克隆抗體制備中的應(yīng)用；了解哺乳動物體細(xì)胞克隆的基本方法以及誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的重要意義；了解CAR-T技術(shù)的基本概念和治療癌癥的原理；學(xué)習(xí)CRISPR的基本原理及其實(shí)際應(yīng)用方法。3.1植物細(xì)胞工程3.1.1

植物組織培養(yǎng)

以植物細(xì)胞具有全能性為基礎(chǔ)發(fā)展起來的一項(xiàng)無性繁殖新技術(shù)。----先從植物體分離出離體的器官、組織、或細(xì)胞；----在無菌條件下接種在含有各種營養(yǎng)物質(zhì)及植物激素的培養(yǎng)基上；----誘導(dǎo)出脫分化的愈傷組織，在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行誘導(dǎo)分化，生成芽和根，

形成完整的植株；----移植到土壤中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)；

優(yōu)點(diǎn)：----打破植物生長的季節(jié)限制；----可獲得大量無毒苗，提高經(jīng)濟(jì)作物的品質(zhì)和產(chǎn)量；3.1.1.1預(yù)備階段

選擇合適的外植體根、莖、葉都可無菌操作除去病原菌及雜菌

配制適宜的培養(yǎng)基基本成分，如蔗糖或葡萄糖，以及氮、磷、鉀、鎂等微量無機(jī)物，如鐵、錳、硼酸微量有機(jī)物，如吲哚乙酸、激動素、肌醇等

配制適宜的培養(yǎng)基基本成分，如蔗糖或葡萄糖，以及氮、磷、鉀、鎂等微量無機(jī)物，如鐵、錳、硼酸微量有機(jī)物，如吲哚乙酸、激動素、肌醇等

配制適宜的培養(yǎng)基基本成分，如蔗糖或葡萄糖，以及氮、磷、鉀、鎂等微量無機(jī)物，如鐵、錳、硼酸微量有機(jī)物，如吲哚乙酸、激動素、肌醇等3.1.1.2誘導(dǎo)去分化階段

培養(yǎng)基中一般應(yīng)添加較高濃度的生長素類激素愈傷組織培養(yǎng)愈傷組織切割成數(shù)塊后移植，繼續(xù)培養(yǎng)3.1.1.3繼代增殖階段3.1.1.4生根發(fā)芽階段

將愈傷組織移置于含適量細(xì)胞分裂素，沒有或僅有少量生長

素的分化培養(yǎng)基中。誘導(dǎo)根生長3.1.1.5移栽成活階段移栽3.1.2.

植物細(xì)胞原生質(zhì)體的制備與融合

原生質(zhì)體（protoplast）：就是脫去全部細(xì)

胞壁的植物細(xì)胞。---方便地進(jìn)行有關(guān)遺傳操作---具有全能性，能發(fā)育成完整植株---細(xì)胞無性系變異和突變體篩選的重要來源---誘導(dǎo)融合形成雜種細(xì)胞3.1.2.1原生質(zhì)體的制備

取材與除菌

：-----取材：種子根、子葉、下胚軸、胚細(xì)胞、花粉母細(xì)胞、

懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和嫩葉。-----除菌：清水洗2～3次,然后浸入70%酒精消毒后,再放進(jìn)3%次氯酸鈉處理。

酶解：纖維素酶、纖維素二糖酶以及果膠酶原生質(zhì)體3.1.2.2原生質(zhì)體的融合

化學(xué)法誘導(dǎo)融合----聚乙二醇(PEG)結(jié)合高鈣、高pH誘導(dǎo)融合

物理法誘導(dǎo)融合----微電極法誘導(dǎo)細(xì)胞融合原生質(zhì)體融合電融合儀3.1.2.3雜合體的鑒別與篩選

雜合細(xì)胞的顯微鏡鑒別----形態(tài)、顏色遺傳互補(bǔ)法篩選雜合細(xì)胞----遺傳互補(bǔ)法采用細(xì)胞與分子生物學(xué)的方法鑒別雜合體----染色體核型分析、染色體顯帶分析、同功酶、核酸分子雜交、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性等根據(jù)再生植株的形態(tài)特征進(jìn)行鑒別3.1.3.單倍體育種--------是指細(xì)胞中僅含一組染色體的個(gè)體單倍體植株特點(diǎn)：

葉小、株矮，生活力弱，且高度不育

不受顯性等位基因的掩蓋與遮蔽效應(yīng)影響，易于挑選出具

有可用性狀的隱性突變體后代不會產(chǎn)生分離，因而遺傳性是穩(wěn)定單倍體二倍體三倍體四倍體單倍體植株培育途徑：孤雌繁殖途徑------植物卵細(xì)胞不經(jīng)受精而發(fā)育成單倍體胚，繼而長成單倍體植株。孤雄繁殖途徑-----精子進(jìn)入胚囊后不與卵細(xì)胞受精而獨(dú)自發(fā)育成單倍體胚，再發(fā)育成株。卵細(xì)胞退化消失。無融合生殖-----助細(xì)胞或反足細(xì)胞也與受精卵形成的二倍體胚同步發(fā)育成單倍體胚，形成雙胚或多胚種子。3.1.3.1花藥培養(yǎng)

選取成熟度適中的花蕾或幼穗

選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基與培養(yǎng)條件缺點(diǎn)：雙倍體植株所占百分比過高3.1.3.2花粉培養(yǎng)

自然散開法-----將花蕾或幼穗在7℃冷處理二周后,讓其在適當(dāng)?shù)囊后w培養(yǎng)基表面培養(yǎng)，待花藥自然開裂散落出花粉后，離心收集花粉，置于培養(yǎng)基中生長缺點(diǎn)：白化苗出現(xiàn)過多3.1.3.3單倍體培養(yǎng)物的加倍

在誘發(fā)單倍體植株的各階段(形成愈傷組織、幼胚及小苗)，都可用秋水仙素處理，使染色體加倍，然后按常規(guī)途徑培養(yǎng)，即可能得到染色體加倍的能正常開花、結(jié)果的二倍體植株。秋水仙素處理后，染色體加倍3.1.4．植物細(xì)胞代謝工程----------指利用轉(zhuǎn)基因技術(shù),對細(xì)胞中的代謝反應(yīng)、代謝物的轉(zhuǎn)運(yùn)過程進(jìn)行調(diào)節(jié),以提高細(xì)胞生產(chǎn)相應(yīng)次生代謝物的能力。3.1.4.1植物細(xì)胞的代謝產(chǎn)物

初級代謝產(chǎn)物(Primarymetabolites)--------指植物細(xì)胞的代謝活動所生成的對自身生長和繁殖所必

需的物質(zhì)，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂類、維生素等。

次生代謝產(chǎn)物(Secondarymetabolites)--------由植物初級代謝產(chǎn)物衍生而來的一類小分子有機(jī)化合物，

它們不是有機(jī)體生長必不可少的物質(zhì)，主要是幫助植物

適應(yīng)周圍環(huán)境。--------分為七大類，包括苯丙素類、醌類、黃酮類、單寧類、類萜、甾體及其甙、生物堿等

紅豆杉與紫杉醇的結(jié)構(gòu)-----紫杉醇又稱為紫杉烷二萜，是從紅豆杉屬的紫杉樹皮中得到的二萜類次生代謝產(chǎn)物，能有效地抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，被廣泛應(yīng)用于治療卵巢癌，乳腺癌和肺癌等。紅豆杉紫杉醇結(jié)構(gòu)3.1.4.2影響植物細(xì)胞生成次生代謝產(chǎn)物的因素培養(yǎng)細(xì)胞的分化程度培養(yǎng)細(xì)胞的不穩(wěn)定性細(xì)胞培養(yǎng)液中次生代謝產(chǎn)物的積累培養(yǎng)過程中植物細(xì)胞聚集成團(tuán)培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)會采取以下措施：

添加茉莉酸（Jasmonates）

即時(shí)清除培養(yǎng)基中所積累的次生代謝產(chǎn)物。

細(xì)胞固定化培養(yǎng)。

改進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的代謝途徑

紫杉醇的合成途徑由異戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基二磷酸（DMAPP）在雙牻牛兒基焦磷酸（GGPP）合成酶的催化下形成GGPP，然后經(jīng)過19種酶的催化，最終形成紫杉醇。3.1.4.3植物代謝產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)

懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)半連續(xù)培養(yǎng)方法：即每隔一定時(shí)間(如1～2天)收獲部分培養(yǎng)物，再加入等量培養(yǎng)基的方法連續(xù)培養(yǎng)方法：即培養(yǎng)若干天后在連續(xù)收獲細(xì)胞的同時(shí)不斷補(bǔ)充培養(yǎng)液的方法封閉式植物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

固定化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

平床培養(yǎng)系統(tǒng):本系統(tǒng)由培養(yǎng)床、貯液罐和蠕動泵等構(gòu)成，設(shè)備較簡單，比懸浮培養(yǎng)體系能更有效地合成次生代謝物。

立柱培養(yǎng)系統(tǒng):將植物細(xì)胞與瓊脂或褐藻酸鈉混合,制成多個(gè)1～2cm3的細(xì)胞團(tuán)塊,放置于無菌立柱中。植物細(xì)胞立柱培養(yǎng)系統(tǒng)3.2動物細(xì)胞工程3.2.1

細(xì)胞、組織培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)指的是離體細(xì)胞在無菌培養(yǎng)條件下的分裂、生長，在整個(gè)培養(yǎng)過程中細(xì)胞不出現(xiàn)分化，不再形成組織。

組織培養(yǎng)意味著取自動物體的某類組織，在體外培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞一直保持原本已分化的特性，該組織的結(jié)構(gòu)和功能持續(xù)無發(fā)生明顯變化。培養(yǎng)中的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)中的組織細(xì)胞3.2.1.1細(xì)胞培養(yǎng)法

培養(yǎng)動物細(xì)胞步驟（無菌條件下）：

分離組織，以培養(yǎng)液漂洗干凈

用無菌刀切成小組織塊組織塊用解離液（含蛋白酶類）離散細(xì)胞離心收集細(xì)胞后，將目的細(xì)胞吸移至培養(yǎng)瓶培養(yǎng)

微導(dǎo)管培養(yǎng)法-------外徑不超過1mm的微導(dǎo)管（硝酸纖維素或醋酸纖維素構(gòu)成）浸沒于培養(yǎng)基中。動物細(xì)胞貼附生長于微管床表面。

微載體培養(yǎng)法------微載體（葡萄糖聚合物制成）與培養(yǎng)基混合均勻，動物細(xì)胞則貼附在微載體表面旺盛地生長。

微膠囊培養(yǎng)法

-----細(xì)胞與褐藻酸鈉混合后，滴加CaCl2，褐藻酸鈉硬化成半透性微膠囊，細(xì)胞在微膠囊內(nèi)生長。微載體培養(yǎng)法3.2.1.2組織培養(yǎng)法

分離組織，用培養(yǎng)液漂洗；用無菌刀將該組織分切成1～2mm3小塊，移入培養(yǎng)瓶；

加入合適的培養(yǎng)基靜置37℃培養(yǎng)。組織接種3.2.1.3培養(yǎng)物的傳代

物理法：用培養(yǎng)液沖洗后，用刮刀剝離培養(yǎng)組織，視組織塊大小進(jìn)行適當(dāng)切割后再漂洗、移置于新培養(yǎng)瓶中。

酶解法(0.25%胰酶)：用酶降解組織細(xì)胞，細(xì)胞懸浮后，分盤培養(yǎng)于新培養(yǎng)瓶中。細(xì)胞傳代3.2.1.4無血清培養(yǎng)

無血清培養(yǎng)基：

基礎(chǔ)培養(yǎng)基,DME培養(yǎng)基與Ham/F12培養(yǎng)基1:1混合

基質(zhì)因子,包括纖黏素、血清鋪展因子、胎球蛋白、膠原和多聚賴氨酸等

生長因子、激素和維生素等約30種有機(jī)和無機(jī)微量物質(zhì),其中包括哺乳動物的絕大多數(shù)內(nèi)分泌激素。無血清培養(yǎng)添加劑3.2.1.5培養(yǎng)物的長期保存

經(jīng)典傳代法：使培養(yǎng)物始終處于活躍生長狀態(tài)

冷凍保存法：

細(xì)胞與5%～10%的甘油或二甲亞砜混勻，封裝于若干個(gè)安瓿瓶中

緩慢降溫(1～3℃/min)至-30℃

繼續(xù)降溫(15～30℃/min)至-150℃

轉(zhuǎn)移至液氮凍存，可無限期保存細(xì)胞逐級降溫3.2.1.6細(xì)胞組織培養(yǎng)污染的防治

一般性細(xì)菌污染無菌操作

培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素及鏈霉素

支原體污染：Plasmocin細(xì)菌污染的細(xì)胞支原體污染的細(xì)胞3.2.2動物細(xì)胞融合3.2.2.1病毒誘導(dǎo)融合

棄上清

滅活仙臺病毒懸液

↗

↓

雙親本細(xì)胞→分別制成細(xì)胞懸液→混合離心→雙親細(xì)胞沉淀

混勻

冰浴20min水浴37℃30min

細(xì)胞凝集

細(xì)胞融合→選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)

間歇搖動

間歇搖動

3.2.2.2化學(xué)誘導(dǎo)融合

聚乙二醇(PEG)：動植物細(xì)胞融合的主要手段pH:7.4～8.0分子量：1000～2000濃度：30%～40%3.2.2.3電激誘導(dǎo)融合

方法參見植物原生質(zhì)體電激融合電融合儀PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合3.2.3單克隆抗體與雜交瘤技術(shù)多克隆抗體：多個(gè)B淋巴細(xì)胞都可以針對同一個(gè)抗原的不同抗原決定簇產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。單克隆抗體：一個(gè)B淋巴細(xì)胞生成的抗體。

從血液中分離單克隆抗體的障礙：

單克隆抗體的濃度太低，

不同的抗體結(jié)構(gòu)類似，常規(guī)的分離方法很難區(qū)分；B淋巴細(xì)胞在體外不分裂，無法通過細(xì)胞培養(yǎng)的方式擴(kuò)增B淋巴細(xì)胞。

雜交瘤技術(shù)：------將骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合,獲得了既能產(chǎn)生單一抗體又能在體外無限生長的雜合細(xì)胞（Kohler和Milstein，1975）3.2.3.1動物免疫皮下免疫：將抗原物質(zhì)與佐劑（弗氏完全佐劑）混合后注射入動物皮下進(jìn)行第一次加強(qiáng)免疫四周后三次加強(qiáng)免疫每隔三周沖擊免疫三天前抗體效價(jià)的檢測動物皮下注射抗原物質(zhì)3.2.3.2雜交瘤細(xì)胞的制備和選擇分離B淋巴細(xì)胞

將鼠骨髓瘤細(xì)胞和Ｂ淋巴細(xì)胞混合

融合細(xì)胞

雜交瘤細(xì)胞RPMI-1640培養(yǎng)基及血清繼續(xù)培養(yǎng)增殖聚乙二醇(PEG取小鼠脾臟篩選擴(kuò)增培養(yǎng)抗體效價(jià)測定（ELISA）篩選出的雜交瘤細(xì)胞3.2.4哺乳動物體細(xì)胞克隆

蘇格蘭PPL生物技術(shù)公司與羅斯林（Roslin）研究所---------維爾穆特(Wilmut)博士第一只體細(xì)胞克隆羊“多莉”（1996,6出生-2003,2死亡）即使是高度分化的哺乳動物體細(xì)胞核仍然具有遺傳全能性體細(xì)胞核克隆動物熱體細(xì)胞克隆牛（1998）：新西蘭、日本、法國體細(xì)胞克隆小鼠（1998）：美國體細(xì)胞克隆騾子，馬，狗，豬，貓克隆馬克隆狗克隆豬克隆貓中國的體細(xì)胞克隆

山羊：西北農(nóng)林科技大學(xué)（2000）體細(xì)胞克隆牛，水牛，黃羊，豬相繼問世

大熊貓的克?。宏惔笤袊茖W(xué)院動物研究所生殖

生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室--------異種卵細(xì)胞質(zhì)核移植：大熊貓的體細(xì)胞核移植入家兔卵細(xì)胞質(zhì)。--------只能發(fā)育至囊胚階段陳大元與異種克隆大熊貓?bào)w細(xì)胞克隆猴

第一只體細(xì)胞克隆猴中中和華華

五只BMAL1基因缺失的體細(xì)胞克隆猴

中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所2017,112019,13.2.4.1多莉的克隆技術(shù)

第一個(gè)母親第二個(gè)母親第三個(gè)母親(成功率只有0.36%)小鼠的克隆技術(shù)：檀香山技術(shù)

克隆羊多莉技術(shù)與檀香山技術(shù)對比3.2.4.2克隆羊多莉的意義與爭議安全性：早衰，突變倫理道德：人的克隆《世界人類基因組與人權(quán)宣言》-------國際上第一個(gè)禁止克隆人的法律文件

中國對克隆人研究--------不贊成、不參與、不資助，也不接受外來科學(xué)家從事這方面研究。3.2.5細(xì)胞重新編程與誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞德國生物學(xué)家魏斯曼(1892年):--------體細(xì)胞分化一旦發(fā)生，將不能回到其未分化狀態(tài)(魏斯曼障礙)德國生物學(xué)家魏斯曼（1834-1914）克隆羊多莉的誕生:--------高度分化的體細(xì)胞可沿著當(dāng)初分化的途徑重新回到分化前的狀態(tài)。3.2.5.1細(xì)胞重新編程

在體外利用“重新編程因子”將成熟體細(xì)胞的分化記憶去除，使已經(jīng)關(guān)閉的，有關(guān)細(xì)胞分化的基因重新表達(dá)，誘導(dǎo)體細(xì)胞重新回到早期干細(xì)胞狀態(tài)，在此基礎(chǔ)上誘導(dǎo)形成各種類型的細(xì)胞，用于替換體內(nèi)損壞的或者失去功能的細(xì)胞。3.2.5.2誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)日本學(xué)者山中伸彌：誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（Inducedpluripotentstemcells，iPS）------普通皮膚細(xì)胞重返干細(xì)胞的狀態(tài)------榮獲2012年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎山中伸彌------同時(shí)轉(zhuǎn)入Oct4,Sox2,cMyc,和Klf4四個(gè)基因3.2.5.3誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的改進(jìn)及應(yīng)用存在的問題：誘導(dǎo)成功率低：0.01～0.1%基因變異誘發(fā)腫瘤改進(jìn)方法小分子誘導(dǎo)：替代Oct4,Sox2,cMyc,和Klf4蛋白質(zhì)誘導(dǎo)

再生醫(yī)學(xué)：治療脊髓損傷、帕金森病等疾病-------日本京都大學(xué)：iPS細(xì)胞誘導(dǎo)成神經(jīng)細(xì)胞（2018,8）iPS細(xì)胞誘導(dǎo)成T細(xì)胞（2018,11)3.2.6免疫細(xì)胞工程----CAR-T技術(shù)CAR-T：ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy

嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法—利用病人自身的免疫細(xì)胞來清除癌細(xì)胞3.2.6.1.T細(xì)胞的種類細(xì)胞毒T細(xì)胞（cytotoxicTcell）輔助T細(xì)胞（helperTcell）調(diào)節(jié)/抑制T細(xì)胞（regulatory/suppressorTcell）記憶T細(xì)胞(memoryTcell)CAR-T技術(shù)就是要在細(xì)胞毒T細(xì)胞（cytotoxicTcell）表面插入嵌合抗原受體(CAR)，賦予細(xì)胞毒T細(xì)胞識別腫瘤抗原的能力。3.2.6.2.T細(xì)胞的激活抗原呈送細(xì)胞（Antigenpresentingcells，APC）雙信號系統(tǒng)信號1：主要組織相容性復(fù)合體（MHC）+抗原短肽/

T細(xì)胞受體（TCR）信號2：B7/CD283.2.6.3CAR的結(jié)構(gòu)第三代CAR蛋白的結(jié)構(gòu)胞外段：信號肽抗體可變區(qū)：識別抗原跨膜段：CD28胞內(nèi)段TCR結(jié)合蛋白Zeta的胞內(nèi)段CD28胞內(nèi)段4-1BB（CD137）胞內(nèi)段3.2.6．4.腫瘤特異性抗原CAR-T細(xì)胞與腫瘤抗原的識別白血?。篊D19抗原肺及前列腺癌：ERRB2（HER-2/neu）抗原腎細(xì)胞癌：CAIX抗原療肺癌和卵巢癌等：LewisY抗原3.2.6.5.治療流程T細(xì)胞分離：從白血病病人身上分離T細(xì)胞T細(xì)胞修飾：制備CAR-T細(xì)胞。擴(kuò)增：體外培養(yǎng)，大量擴(kuò)增CAR-T細(xì)胞回輸：把擴(kuò)增好的CAR-T細(xì)胞回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)。監(jiān)控：預(yù)防細(xì)胞因子釋放綜合癥（Cytokinereleasesyndrome）時(shí)間：3個(gè)星期左右，其中細(xì)胞“提取-修飾-擴(kuò)增”需要約2個(gè)星期。3.2.7動物細(xì)胞制藥工程—重組蛋白質(zhì)制品原核細(xì)胞

細(xì)菌：缺少翻譯后修飾真核細(xì)胞：糖基化，折疊，酶切，二硫鍵

酵母細(xì)胞

昆蟲細(xì)胞

哺乳細(xì)胞

3.2.7.1生產(chǎn)藥物的主要動物工程細(xì)胞

中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO):生物制藥領(lǐng)域內(nèi)的主力軍。

具有和人體細(xì)胞相似的翻譯后修飾；

監(jiān)管機(jī)構(gòu)的認(rèn)可；

較少的內(nèi)源分泌性蛋白；

在無血清及限定培養(yǎng)基中可快速穩(wěn)健地懸浮生長；

無病毒感染后所帶來的安全性問題;

幾十年來積累的知識和經(jīng)驗(yàn)。

目前60%以上的生物藥品是由這種細(xì)胞生產(chǎn)出來的

倉鼠腎臟(BHK)細(xì)胞：常用來生產(chǎn)抗血友病的產(chǎn)品諾其（NovoSeven）凝血因子Ⅷ（Kogenate）。

小鼠骨髓瘤細(xì)胞（NS0或SP2/0）：主要生產(chǎn)單克隆抗體類藥物

治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎：類克（Remicade）

治療結(jié)直腸癌：愛必妥（Erbitux）預(yù)防小兒呼吸道病毒感染：帕利珠單抗（Synagis）治療紅斑狼瘡：貝利木單抗（Benlysta）

人成纖維肉瘤細(xì)胞HT1080：蛋白酶制品

治療黏多糖貯積癥：艾杜硫酶(Elaprase)

治療脂肪積聚（法布里?。篟eplagal

治療I型戈謝?。篤priv人胚胎腎細(xì)胞HEK293：生產(chǎn)治療血友病和糖尿病的藥物重組抗血友病因子：Eloctate、Alprolix降血糖藥：Trulicity（度拉魯肽）3.2.7.2工程細(xì)胞的改進(jìn)

永生化目的基因的定點(diǎn)插入抗細(xì)胞凋亡細(xì)胞周期的阻滯分子伴侶（chaperone）的表達(dá)蛋白質(zhì)分泌代謝產(chǎn)物蛋白質(zhì)糖基化3.2.7.3工程細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)

無血清培養(yǎng)

懸浮培養(yǎng)

流加培養(yǎng)及灌注培養(yǎng)3.3基因編輯技術(shù)-CRISPR3.3.1CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究歷史1987年日本學(xué)者吉住石野

大腸桿菌中克隆堿性磷酸同工酶—NNNN—5個(gè)連續(xù)且高度同源的重復(fù)序列29bp32bp29bp2001年,西班牙學(xué)者FranciscoMojica和RuudJansen

命名為重復(fù)序列CRISPR(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)，即“成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列”2007年,美國學(xué)者RodolpheBarrangou

證實(shí)了CRISPR是一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)2008年,Brouns和Vand