關(guān)于男科學(xué)實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)展第1頁，幻燈片共52頁

精液分析是評價男性生育能力的最基本檢驗(yàn)手段。理論上，精液分析是一個很簡單的操作過程，只要將一滴精液置于玻片上，進(jìn)而確定其相關(guān)參數(shù)即可。然而，實(shí)際上，精液分析所得的每一個參數(shù)都需要大量的專業(yè)知識、細(xì)致認(rèn)真的操作及必要的質(zhì)量控制措施。第2頁，幻燈片共52頁

Keel等報(bào)告了美國紐約、哥倫比亞、洛山磯、明尼蘇達(dá)幾百家男科實(shí)驗(yàn)室對精子密度、形態(tài)學(xué)、活率及抗精子抗體的室間質(zhì)量控制結(jié)果，精子密度的結(jié)果顯示，一份精液標(biāo)本的精子密度差異范圍達(dá)3~492×106/ml，手工檢測的變異系數(shù)（CV）為30%~138%，計(jì)算機(jī)輔助的精液分析（CASA）的CV為24%~99%。不同實(shí)驗(yàn)室精子密度的較大差異提示，精子計(jì)數(shù)方法的不同、計(jì)數(shù)池種類的不同以及操作的標(biāo)準(zhǔn)化對精子計(jì)數(shù)結(jié)果有著直接的影響。第3頁，幻燈片共52頁一、精液常規(guī)檢查

1、精液檢測工具不斷更新（1）血細(xì)胞計(jì)數(shù)板沿用50余年

（2）Makler精子計(jì)數(shù)板1978年以色列Makler發(fā)明（3）Macro精子計(jì)數(shù)板（4）Microcell計(jì)數(shù)池1990年Ginabury和Armand發(fā)明一次性使用（5）2004年，美國MillenniumSciences公司Cell-VU精子記數(shù)池和Cell-VU預(yù)染色形態(tài)載波片。

第4頁，幻燈片共52頁計(jì)算機(jī)輔助的精液分析

80年代發(fā)展的新技術(shù)，除可分析精子密度、活動百分率等指標(biāo)外，在分析精子運(yùn)動能力方面顯示了其獨(dú)特的優(yōu)越性。第5頁，幻燈片共52頁第6頁，幻燈片共52頁第7頁，幻燈片共52頁第8頁，幻燈片共52頁第9頁，幻燈片共52頁第10頁，幻燈片共52頁第11頁，幻燈片共52頁第12頁，幻燈片共52頁全自動精子分析儀（以色列）MedicalElectronicSystems第13頁，幻燈片共52頁

用已知濃度的乳膠珠溶液對目前國際上常用的３種精子計(jì)數(shù)池進(jìn)行了評價。

３種精子計(jì)數(shù)池的質(zhì)量評估第14頁，幻燈片共52頁1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料

Cell-VU計(jì)數(shù)池（MillenniumSciencesInc，NewYork，USA）Makler計(jì)數(shù)池（Sefi-MedicalInstrument，Haifa，Israel）血球計(jì)數(shù)池（上海求精生化試劑儀器有限公司）標(biāo)準(zhǔn)乳膠珠溶液（HamiltonThorneBiosciences，USA）2份，濃度分別為：（35±5）×106/ml，（18±2.5）×106/ml。第15頁，幻燈片共52頁1.２方法1.2.1Cell-VU計(jì)數(shù)法1.2.2Makler計(jì)數(shù)法1.2.3血球計(jì)數(shù)池法1.３統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

不同計(jì)數(shù)池的計(jì)數(shù)結(jié)果以x±s表示，樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)

第16頁，幻燈片共52頁2結(jié)果ChambernConcentrationforstandardsolution1Concentrationforstandardsolution2Cell-VU3037.63±4.8918.22±1.77Hemacytometer3042.74±4.98*20.48±1.56*Makler1553.52±6.67*△24.97±4.75*△表1不同精子計(jì)數(shù)池的乳膠珠濃度與Cell-VU計(jì)數(shù)池相比，*：P<0.001；與血球計(jì)數(shù)池相比，△：P<0.001第17頁，幻燈片共52頁Cell-VU計(jì)數(shù)池的濃度最接近標(biāo)準(zhǔn)乳膠珠的濃度，平均變異系數(shù)（CV）分別為7.51%和1.22%，而血球計(jì)數(shù)池的CV分別為22.11%和13.78%，Makler計(jì)數(shù)池的CV分別為52.91%和38.72%。提示，Cell-VU計(jì)數(shù)池計(jì)數(shù)結(jié)果最準(zhǔn)確，而血球計(jì)數(shù)池和Makler計(jì)數(shù)池計(jì)數(shù)結(jié)果明顯偏高，尤以Makler計(jì)數(shù)池與標(biāo)準(zhǔn)乳膠珠濃度相差最大，差異達(dá)52.91%。

第18頁，幻燈片共52頁室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)控是保證不同實(shí)驗(yàn)室結(jié)果準(zhǔn)確和可靠的重要措施之一。精子計(jì)數(shù)是男科實(shí)驗(yàn)室目前考慮較多的質(zhì)控項(xiàng)目之一，目前最大的挑戰(zhàn)來自精子計(jì)數(shù)方法學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)化和監(jiān)測。本研究顯示，Cell-VU計(jì)數(shù)池的準(zhǔn)確性和精確性均優(yōu)于血球計(jì)數(shù)池和Makler計(jì)數(shù)池，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。而且，Cell-VU可一次性或反復(fù)多次使用，這在計(jì)數(shù)傳染性較強(qiáng)的樣本時將顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢。因此，我們建議要建立一個標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)數(shù)池操作系統(tǒng)用于所有實(shí)驗(yàn)室，從而為不同實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制評價提供基礎(chǔ)，最終提高所有實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。Cell-VU應(yīng)是此標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)池的最佳選擇。

第19頁，幻燈片共52頁2.精子功能測定

（1）傳統(tǒng)經(jīng)典的“倉鼠卵穿刺實(shí)驗(yàn)”（2）精子-宮頸粘液穿透試驗(yàn)（3）毛細(xì)管穿透試驗(yàn)（4）低滲腫脹試驗(yàn)（5）吖啶橙染色(熒光顯微鏡)

（6）精子DNA完整性檢測（流式細(xì)胞儀）

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精子DNA完整性檢測亦稱精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，SCSA），是應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測精子功能的方法之一。精子發(fā)生過程中，魚精蛋白逐步取代組蛋白與DNA結(jié)合。精子進(jìn)入附睪后，魚精蛋白的組成不再改變。但附睪中精子在逐步成熟的過程中，魚精蛋白中大量的巰基(SH)不斷被氧化成二硫鍵(S=S)，與DNA結(jié)合更加緊密，使DNA更具抗酸能力，維持了雙鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。精子DNA完整性檢測（流式細(xì)胞儀）第21頁，幻燈片共52頁

而染色質(zhì)異常的精子，魚精蛋白中多數(shù)巰基未被氧化，在酸的作用下易變性為單鏈DNA。根據(jù)這一原理，用酸處理精液樣品，再行吖啶橙(AO)染色，AO可與雙鏈DNA結(jié)合呈單體形式發(fā)出綠色熒光，與單鏈DNA結(jié)合呈聚合物形式發(fā)出紅或黃色熒光。然后通過配有專用軟件的流式細(xì)胞儀可進(jìn)行數(shù)據(jù)處理得出SCSA參數(shù)。精子DNA完整性檢測（流式細(xì)胞儀）第22頁，幻燈片共52頁二、生精細(xì)胞檢查與睪丸活檢1、生精細(xì)胞檢查精液中除成熟的精子外，亦可見未成熟的生精細(xì)胞，包括精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、早期和晚期精子細(xì)胞等

生精細(xì)胞檢查方法：

染色法熒光原位雜交單克隆抗體免疫組化法流式細(xì)胞術(shù)第23頁，幻燈片共52頁2、睪丸活檢

開放活檢、細(xì)針穿刺、活檢槍、高能多譜勒超聲為基礎(chǔ)的睪丸活檢

70年代FSH可用放免方法測定，F(xiàn)SH水平可以反映生精功能受損程度，睪丸活檢范圍逐漸縮小，其適應(yīng)證僅限于睪丸體積正常、FSH水平正常或輕度增高的無精子癥病人。

80年代，精漿生化指標(biāo)的測定可排除阻塞性無精子癥，睪丸活檢范圍更小。近年來，隨著顯微外科的發(fā)展和顯微受精技術(shù)的應(yīng)用，從精液中分離一條精子即可使卵子受精達(dá)到生育目的。因此，需行睪丸活檢的病例更是寥寥無幾。第24頁，幻燈片共52頁三、白細(xì)胞精子癥的檢測

精液白細(xì)胞數(shù)>1×106/ml，可診斷為白細(xì)胞精子癥白細(xì)胞可通過吞噬作用、產(chǎn)生活性氧（ROS）、分泌一些細(xì)胞因子等途徑使精子損傷。精液中粒細(xì)胞為產(chǎn)生ROS的主要細(xì)胞。

第25頁，幻燈片共52頁精液中白細(xì)胞的檢測方法；1、對ROS的檢測：依賴魯米諾的化學(xué)發(fā)光分析法2、直接鏡檢法3、瑞-姬染色或巴氏染色法染色4、過氧化物酶染色法（正甲苯胺蘭、聯(lián)苯胺及鄰甲苯胺過氧化物酶染色）5、熒光原位雜交法6、免疫細(xì)胞化學(xué)法CD45，CD4，CD87、彈性蛋白酶、IL-8及溶菌酶測定

第26頁，幻燈片共52頁四、免疫性不育的檢測

檢測方法很多，3種類別的抗精子抗體均可測，檢測的抗精子抗體為總的或各種類別的抗精子膜抗原的抗體，而精子膜與人體其他器官組織的細(xì)胞膜有許多共同抗原，因而這種抗原抗體反應(yīng)的特異性不高。如果用針對精子或睪丸特異性抗原，或針對與透明帶識別和結(jié)合有關(guān)的抗原作為包被抗原來檢測AsAb，其臨床意義就會很大。

Naz等用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)確定，受精抗原FA-1和YLP（12）具有此特性，并且它們的抗體存在于不育男性的精漿和血清中建立這種特異性診斷方法是今后取代總AsAb檢測的唯一途徑。第27頁，幻燈片共52頁五、生殖道感染的檢測

大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、綠膿桿菌、淋球菌、肺炎克雷伯氏菌、結(jié)核桿菌、衣原體、支原體、單純皰疹病毒、人乳頭瘤病毒、腺相關(guān)病毒、陰道毛滴蟲等皆可感染生殖道，而且可致不育。各種細(xì)菌感染，往往通過菌體本身及其釋放出的毒素、酶類等影響精子質(zhì)量病毒的感染更為隱蔽臨床實(shí)驗(yàn)室多用ELISA法檢測各種病毒的抗體，通過抗體的分型可粗略判斷病毒的感染時期第28頁，幻燈片共52頁衣原體和支原體感染被認(rèn)為是最常見的性傳播疾?。⊿TD）病原與男性不育密切相關(guān)的衣原體為沙眼衣原體（CT），其可引起急性附睪炎和慢性前列腺炎等。目前，檢測沙眼衣原體感染的方法主要有金標(biāo)法、ELISA法及培養(yǎng)法，尤以ELISA法最為常用與男性不育密切相關(guān)的支原體為解脲支原體臨床實(shí)驗(yàn)室多采用培養(yǎng)法檢測。第29頁，幻燈片共52頁六、精漿生化的檢測

精漿中的一些生化標(biāo)志可反映男性附屬性腺、附睪及睪丸生精功能等，有利于綜合評價不育的發(fā)病原因和機(jī)制。例如，檸檬酸、鋅、鎂、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和酸性磷酸酶可反映前列腺功能，其中的酸性磷酸酶檢測已成為男科實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢查，常用磷酸苯二鈉法；

果糖與前列腺素可反映精囊腺功能，常用間苯二酚法檢測果糖；

游離左旋肉毒堿、甘油磷酸膽堿和α-葡糖苷酶可反映附睪功能。第30頁，幻燈片共52頁精漿總α-葡糖苷酶檢測中應(yīng)注意3點(diǎn)離心速度不同，精漿總α-葡糖苷酶活性有所差異精漿總α-葡糖苷酶活性與禁欲時間的長短密切相關(guān)精漿總α-葡糖苷酶活性的檢測應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量控制

第31頁，幻燈片共52頁不同速度離心后的精漿中α葡糖苷酶水平第32頁，幻燈片共52頁禁欲時間對精漿α葡糖苷酶的影響Abstinencetime(day)nAlpha-glucosidase(U/ml)Seminalplasma(1000gfor10min)Seminalplasma(3000gfor15min)2~31236.47±12.2434.04±11.224~51649.62±16.86*47.73±17.37*6~71451.14±19.76*46.76±17.70*>8968.70±14.10*#△63.86±13.63*#△第33頁，幻燈片共52頁精漿果糖檢測中應(yīng)注意4點(diǎn)：①果糖標(biāo)準(zhǔn)液配制后應(yīng)放置2周后使用，而使用2周后出現(xiàn)吸光度降低時應(yīng)立即更換新的果糖標(biāo)準(zhǔn)液②離心速度不同精漿果糖濃度稍有差異③精液液化后應(yīng)立即離心將精子和精漿分離，否則會影響精漿果糖檢測結(jié)果④精漿果糖測定中應(yīng)引入質(zhì)量控制體系第34頁，幻燈片共52頁果糖標(biāo)準(zhǔn)液吸光度的監(jiān)測第35頁，幻燈片共52頁精液放置時間對果糖濃度的影響GroupnFructose(mmol/L)0h4815.73±6.562h4815.07±6.56a4h4814.73±6.51b,c第36頁，幻燈片共52頁精漿稀釋后放置時間對酸性磷酸酶活性的影響

隨機(jī)選取10例精漿，1∶10000稀釋后立即檢測ACP活性或稀釋后放置30min再次檢測ACP活性，兩者比較有極顯著性差異（t

＝3.770，P

＝0.001）。第37頁，幻燈片共52頁

抑制素B被認(rèn)為是男性精子發(fā)生的血清標(biāo)志物。成年男性血清中維持可檢測的抑制素B水平需要生精細(xì)胞的存在，唯支持細(xì)胞綜合征（SCO）男性血清抑制素B水平極低。

Brugo-Olmedo等認(rèn)為血清抑制素B在預(yù)言非阻塞性無精子癥病人的睪丸精子存在時比血清FSH更準(zhǔn)確。除此之外，抑制素B還可用于兒童隱睪、性早熟的診斷，監(jiān)測放、化療對男性生精功能的損傷等。目前，抑制素B的檢測通常使用雙抗體夾心ELISA法。第38頁，幻燈片共52頁七、精漿細(xì)胞因子的檢測

精漿細(xì)胞因子由男性泌尿生殖道內(nèi)的各種細(xì)胞分泌，包括轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）、表皮生長因子（EGF）、腫瘤壞死因子（TNF）、各種白細(xì)胞介素（IL）及某些可溶性受體等。目前認(rèn)為，與男性不育有關(guān)的細(xì)胞因子主要有IL-6和IL-8，不育病人精漿中IL-6和IL-8水平明顯高于生育力正常的男性。測定IL-6和IL-8的方法有：生物學(xué)方法、分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法，以免疫學(xué)方法多用，尤以ELISA和RIA常用。

第39頁，幻燈片共52頁

八、精子發(fā)生相關(guān)基因的檢測

與精子發(fā)生相關(guān)的基因很多，無精子病人的基因缺失均發(fā)生于Y染色體的長臂,主要位于Yq11.23中，而且并非是單一基因，可能含有整個基因大家族。

1996年，Vogt等人在更大范圍對無精子、少精子病人進(jìn)行了研究，認(rèn)為在3個區(qū)域均存在AZF，分別為AZFa，AZFb，AZFc，對這些病人睪丸活檢發(fā)現(xiàn)，睪丸的病理改變與AZF的缺失部位有顯著相關(guān)性。

AZFa：Sy84,Sy86AZFb：Sy124，Sy127，Sy132,Sy134AZFc：Sy152，Sy157，Sy239，Sy242，Sy254，Sy255

第40頁，幻燈片共52頁AZF檢測：SRY存在于基因組中，Yq上的AZFa,b,c區(qū)域的位點(diǎn)全部丟失↓

病人正常男性正常女性空白對照第41頁，幻燈片共52頁九、遺傳學(xué)檢測

男性不育的遺傳學(xué)檢測主要是檢測精子染色體的異常。常規(guī)使用染色體顯帶技術(shù)，如G帶、Q帶等技術(shù)，然而其敏感度不及FISH技術(shù)

FISH技術(shù)可用于研究復(fù)雜染色體突變?nèi)缧匀旧w異常、未知的小標(biāo)志物、環(huán)狀染色體、嵌合體及易位等

Y染