消毒劑消毒效力及有效期驗證方案00***PHARMACEUTICALCO.,LTD****藥業(yè)有限公司CleaningandSanitizingCompoundstheEffectoftheProgrammeValidationProtocol消毒劑消毒效力及有效期確認驗證方案Doc.No./編號：VP8009-01Page/頁碼：14/17ThisDoc.isconfidential.Anyunauthorizeduseandcopyisforbidden.僅限****藥業(yè)有限公司內部使用。未經授權，不得使用或拷貝。CleaningandSanitizingCompoundstheEffectoftheProgrammeValidationProtocol消毒劑消毒效力及有效期確認驗證方案方案審核批準:ProtocolReview/ApprovalSignatures方案審核/批準簽字Date日期Draftedby/起草人（QC）Reviewedby/審核人（QC技術主管）（QA驗證專員）（QA主管）Approvedby/批準人（質量總監(jiān)）菌液配制及計數(shù)（TM7006-01）藥品生產驗證指南2003版微生物檢測驗證技術（中國醫(yī)藥科技出版社）概述本公司的潔凈區(qū)分為A級、C級和D級，擬定用于潔凈區(qū)表面消毒的有七種消毒劑：75%乙醇、0.1%新潔爾滅溶液、0.3%新潔爾滅溶液、0.1%醋酸洗必泰、0.5%醋酸洗必泰、40mg/L的二氧化氯、60mg/L的二氧化氯。本次驗證方案將選用以上7種消毒劑分別進行驗證試驗。作用對象一樣的消毒劑每月輪換使用，避免表面微生物產生耐藥菌株。在利用消毒劑進行表面擦拭消毒過程中消毒劑的作用時間應不少于10分鐘，利用消毒劑進行浸泡消毒的不少于10分鐘。消毒劑的種類、消毒對象、消毒方法和有效期序號名稱消毒對象消毒方法有效期175%乙醇用于設備表面、器具和手消毒。采用擦拭或噴灑方式密閉保存C級：7天D級：30天240mg/L二氧化氯溶液用于地面、墻面和器具的消毒采用擦拭方式密閉保存C級：7天D級：30天360mg/L二氧化氯溶液用于工作服、清潔布和拖布的消毒采用浸泡方式密閉保存C級：7天D級：30天40.1%新潔爾滅溶液用于地面、墻面、器具、工作服、清潔布、拖布和潔凈鞋的消毒采用擦拭或浸泡方式密閉保存C級：7天D級：30天50.3%的新潔爾滅溶液用于水池和地漏的消毒用于液封密閉保存C級：7天D級：30天60.5%醋酸洗必泰溶液用于水池和地漏的消毒用于液封密閉保存C級：7天D級：30天70.1%醋酸洗必泰溶液用于工作服、清潔布、拖布和潔凈鞋的消毒采用浸泡方式密閉保存C級：7天D級：30天為了確認消毒劑的消毒效力，通過實驗室考察部分和現(xiàn)場考察部分分別進行驗證。其中，用定量懸浮試驗法和表面實驗法進行實驗室考察試驗部分。潔凈區(qū)設施表面材質有不銹鋼和玻璃兩種，故表面試驗法選用不銹鋼載片和玻璃裁片模擬潔凈區(qū)設施表面進行驗證試驗。兩種試驗方法作用的消毒劑見表。序號試驗方法消毒劑1表面實驗法75%乙醇240mg/L二氧化氯溶液30.1%新潔爾滅溶液4定量懸浮試驗法0.3%的新潔爾滅溶液50.1%新潔爾滅溶液660mg/L二氧化氯溶液70.1%醋酸洗必泰溶液80.5%醋酸洗必泰溶液現(xiàn)場考察試驗部分選擇固體車間（D級）的制粒一、QC微生物檢測室（C級）、QC微生物檢測室超凈工作臺（A級）設備表面消毒前和消毒后分別進行取樣，測定其微生物數(shù)量。確認前準備確認的相關SOP和在驗證過程中用到的相關文件，將檢查結果記錄在《文件檢查》內，見附錄1。驗證小組的成員已進行該驗證方案及相關SOP的培訓，將檢查結果記錄在《培訓》內，見附錄2。驗證用試劑與材料菌種序號名稱序列號1金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]2大腸埃希菌[CMCC(B)44102]3枯草桿菌芽孢[CMCC(B)63501]4白色念珠菌[CMCC(F)98001]培養(yǎng)基序號名稱備注1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基經121℃，20min滅菌備用2營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基3改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基4改良馬丁培養(yǎng)基5大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基接觸碟（編號：BZW12085）規(guī)格：：55mm，取樣面積為25m26玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)接觸碟（編號：BZW15129）序號消毒劑名稱中和劑備注175%乙醇1%卵磷脂+0.1%聚山梨酯80中和劑經121℃，20min滅菌備用。20.1%新潔爾滅溶液30.3%的新潔爾滅溶液40.5%醋酸洗必泰溶液50.1%醋酸洗必泰660mg/L二氧化氯溶液0.5%硫代硫酸鈉740mg/L二氧化氯溶液消毒液擬定選用的中和劑稀釋液0.9%無菌氯化鈉溶液（NS）器具及設備序號名稱規(guī)格/型號1無菌移液管0.5ml、5ml、10ml2錐形瓶150ml3無菌試管N/A4漩渦混合器XW-80A5恒溫水浴鍋HWS-266恒溫恒濕培養(yǎng)箱HWS-2507恒溫恒濕培養(yǎng)箱HWS-250驗證用試劑與材料記錄見附錄3。消毒劑消毒效力試驗中和劑鑒定試驗試驗目的通過該試驗，確認所用的中和劑對對應的消毒劑有良好的中和作用，對試驗用菌劑及其恢復期培養(yǎng)示范有害或不良影響。菌液的制備及計數(shù)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌工作菌液的制備接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時。取上述培養(yǎng)物用0.9％無菌氯化鈉溶液做10倍系列稀釋成5×105~5×106CFU/ml的工作菌液（如肉湯培養(yǎng)物的濃度已為1×108~5×108CFU/ml，可不再用0.9％無菌氯化鈉溶液稀釋）。計數(shù)時，將5×105~5×106CFU/ml的工作菌液10倍系列稀釋成含50～100CFU/ml菌液，并同時采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基30～35℃培養(yǎng)2天計數(shù)。計算該稀釋級的平均菌落數(shù)，將計數(shù)結果換算成每毫升濃菌液的菌落數(shù)。白色念珠菌工作菌液的制備接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48小時。取上述培養(yǎng)物用0.9％無菌氯化鈉溶液做10倍系列稀釋成5×105~5×106CFU/ml的工作菌液（如肉湯培養(yǎng)物的濃度已為5×105~5×106CFU/ml，可不再用0.9％無菌氯化鈉溶液稀釋）。計數(shù)時，將5×105~5×106CFU/ml的工作菌液10倍系列稀釋成含50～100CFU/ml菌液，并同時采用改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基23～28℃培養(yǎng)3天計數(shù)。計算該稀釋級的平均菌落數(shù)，將計數(shù)結果換算成每毫升濃菌液的菌落數(shù)。鑒定試驗操作配制75%乙醇、0.1%新潔爾滅溶液、0.3%新潔爾滅溶液、0.1%醋酸洗必泰、0.5%醋酸洗必泰、40mg/L的二氧化氯、60mg/L的二氧化氯，具體操作執(zhí)行《清潔劑和消毒劑管理》。將配置好的消毒劑置20℃±1℃恒溫水浴鍋中備用。分組操作試驗分組及稀釋操作方法簡表組號混合液A混勻作用10min混合液B混勻作用10min取混合液B或混合液B的稀釋級溶液0.5ml平板計數(shù)（2皿/組）取0.5ml工作菌液加入下列溶液中取混合液A0.5ml加入下列溶液1消毒劑4.5ml稀釋液4.5ml混合液B、10-12消毒劑4.5ml中和劑4.5ml混合液B、10-13中和劑4.5ml稀釋液4.5ml10-2、10-34中和產物4.5ml（消毒液與中和劑比例為1:1）稀釋液4.5ml10-2、0-35稀釋液4.5ml稀釋液4.5ml10-2、10-36稀釋液和中和劑各1.0ml注入無菌平皿中，各制備2皿，作為陰性對照組。具體操作第1組目的：觀察消毒液對試驗菌有無殺滅或抑制能力。操作：取消毒劑4.5ml+工作菌液0.5ml，混勻作用10min后，取混合液B0.5ml+稀釋液4.5ml，混勻作用10min，取混合液B和10-10.5ml注皿，平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置30～35℃培養(yǎng)3天計數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置23～28℃培養(yǎng)5天計數(shù)計數(shù)。第2組目的：觀察殘留消毒劑被中和后受到消毒劑作用后的試驗菌是否恢復生長。操作：取消毒劑4.5ml+工作菌液0.5ml，混勻作用10min后，取混合液A0.5ml+中和劑4.5ml，混勻作用10min，用稀釋液稀釋成10-1。分別取未稀釋溶液即混合液B（混合液0.5mll+中和劑4.5ml的混合液）及10-10.5ml注皿，各平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置于30～35℃培養(yǎng)3天計數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置于23～28℃培養(yǎng)5天計數(shù)。第3組目的：觀察中和劑是否有抑菌性、毒性操作：取中和劑4.5ml+工作菌液0.5ml，混勻作用10min，取混合液0.5mll+稀釋液4.5ml，混勻作用10min后，用稀釋液進行10倍系列稀釋成10-2、10-3。取相應稀釋級0.5ml注皿，各稀釋級平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置30～35℃培養(yǎng)3天計數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置23～28℃培養(yǎng)5天計數(shù)計數(shù)。第4組目的：觀察中和產物，或未被完全中和殘留消毒劑對試驗菌的生長繁殖是否有影響。操作：取消毒劑和中和劑1:1的混合液4.5ml+工作菌液0.5ml，混勻作用10min，取混合液0.5mll+稀釋液4.5ml，混勻作用10min后，用稀釋液進行10倍系列稀釋成10-2、10-3。取相應稀釋級0.5ml注皿，各稀釋級平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置30～35℃培養(yǎng)3天計數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置23～28℃培養(yǎng)5天計。第5組目的：作陽性對照用操作：取稀釋液4.5ml+工作菌液0.5ml，混勻作用10min，取混合液0.5mll+稀釋液4.5ml，混勻作用10min后，用稀釋液進行10倍系列稀釋成10-2、10-3。取相應稀釋級0.5ml注皿，各稀釋級平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置30～35℃培養(yǎng)3天計數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置23～28℃培養(yǎng)5天計數(shù)。第6組目的：作為陰性對照用操作：分別取稀釋液和中和劑各1.0ml注入無菌平皿中，各制備2皿。結果判斷試驗結果應符合下列全部條件，判斷所選中和劑合格。第1組無菌生長，或僅有少數(shù)試驗菌菌落生長。第2組菌落數(shù)比第1組菌落數(shù)多，但比第3、4、5組菌落數(shù)少，且符合下表要求第1組平板平均菌落數(shù)第2組平板平均菌落數(shù)0〉5x〉(x+5)y〉(y+0.5y)第3、4、5組有相似菌落數(shù)生長，其每組間菌落數(shù)誤差率不超過15%。計算公式如下：（3組間菌落平均數(shù)-各組菌落平均數(shù)）的絕對值之和誤差率＝————————————————————————×100％3×3組間菌落平均數(shù)第6組無菌生長。否則，說明試劑有污染，應重新進行試驗。中和劑鑒定試驗記錄見附錄4。定量懸浮試驗試驗目的由于0.3%的新潔爾滅溶液、0.1%新潔爾滅溶液、60mg/L二氧化氯溶液、0.1%醋酸洗必泰溶液、0.5%醋酸洗必泰溶液是通過浸泡或液封消毒，通過定量懸浮試驗，確定其消毒效力是否符合要求。試驗操作配制0.3%的新潔爾滅溶液、0.1%新潔爾滅溶液、60mg/L二氧化氯溶液、0.1%醋酸洗必泰溶液、0.5%醋酸洗必泰溶液，操作執(zhí)行《清潔劑和消毒劑管理》。將配置好的消毒劑置20℃±1℃恒溫水浴鍋中備用。由于0.3%的新潔爾滅溶液、0.1%新潔爾滅溶液中低效消毒劑，且不能殺滅芽孢，故定量懸浮試驗用菌為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌。0.1%醋酸洗必泰、0.5%醋酸洗必泰溶液、60mg/L二氧化氯溶液為高效消毒劑，能殺滅芽孢，故定量懸浮試驗用菌枯金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌。將菌液制備成1×107~1×107CFU/ml的工作菌液，菌液的制備及計數(shù)同8.1.2。將試管按需要分組排列在試管架上，試驗組分3組（8min、10min、12min各一組），并由左向右逐管標明消毒劑、中和劑、10-1、10-2。對照組分1組，并由左向右逐管標明稀釋液、中和劑、10-1、10-2、10-3、10-4。。向個試管加入4.5ml相應的試劑，標明10-1、10-2、10-3、10-4。加入4.5ml的稀釋液。吸取工作菌液0.5ml加入標明消毒劑的試管中，對照組加入標明稀釋液的試管中，迅速混勻，并開始計時。待菌液與消毒劑相互作用至8min、10min、12min，吸取菌液和消毒劑混合液0.5ml，加入標明中和劑的試管中，迅速混勻。中和作用10min后，吸取0.5ml加入標明10-1的試管中，混勻后吸取0.5ml加入標明10-2試管中（對照組以此類推，對照組直至10-4）。試驗組分別取中和劑管、10-1、10-2管溶液1ml按平皿法測定存活菌數(shù)；對照組取10-3、10-41ml按平皿法測定存活菌數(shù)。每管平行制備2皿。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置于30～35℃培養(yǎng)2天計數(shù)；白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置于23～28℃培養(yǎng)3天計數(shù)計數(shù)。結果計算計算試驗組和對照組的活菌濃度

（CFU/ml），并換算為對數(shù)值（N），并按下式計算殺滅對數(shù)值:殺滅對數(shù)值

(KL)＝對照組平均活菌濃度的對數(shù)值（NO）－試驗組活菌濃度對數(shù)值（NX）可接受標準殺滅對數(shù)值

(KL)應不低于3~5個對數(shù)單位。定量懸浮試驗記錄見附錄5表面試驗法試驗目的由于75%乙醇、40mg/L二氧化氯溶液、0.1%新潔爾滅溶液是通過擦拭消毒，故選用不銹鋼載片和玻璃裁片進行表面試驗法，確定其消毒效力是否符合要求。菌種選擇由于75%乙醇、0.1%新潔爾滅溶液中低效消毒劑，且不能殺滅芽孢，故表面試驗用菌為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌。40mg/L二氧化氯溶液為高效消毒劑，能殺滅芽孢，故表面試驗用菌枯金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌。工作菌液制備工作菌液的制備方法、濃度及驗證同步計數(shù)操作同8.1.2。試驗操作染菌不銹鋼載片制備將經滅菌的載片平鋪于無菌平皿內，滴加金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌含菌量為1×108~5×108CFU的菌液0.1ml，并均勻涂布于整個載體表面。滴染菌液后，載片置超凈工作臺晾干后備用。每種菌平行制備兩個染菌不銹鋼載片。（2）染菌玻璃載片制備因培養(yǎng)皿的材質為玻璃，故用培養(yǎng)皿代替玻璃載片進行染菌試驗。進行菌液滴染前，用記號筆在培養(yǎng)皿菌液滴染面的背面畫出染菌面積（50mm×50mm），標注清晰。菌液滴染操作同染菌不銹鋼載片制備。試驗組：將消毒劑擦拭在制備好的染菌載片上，消毒劑作用時間分別為8min、10min、12min，不銹鋼載片和玻璃載片每個作用時間分別制備2個。作用結束后，用接觸碟取樣（接觸碟規(guī)格：55mm，取樣面積為25m2）。取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌用大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基接觸碟（編號：BZW12085）；取樣白色念珠菌用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基接觸碟（編號：BZW15129）。接觸碟取樣方法：打開接觸碟蓋，使無菌培養(yǎng)基表面與取樣面直接接觸，均勻按壓接觸碟底板，確保全部瓊脂表面與取樣面表面均勻接觸10秒左右，在蓋上跌蓋。對照組對照組的活菌濃度計數(shù)見8.3.3。.陰性對照：用接觸碟在已滅菌的載片上（未染菌片的載）按壓取樣，操作同上。每種載片及每種接觸碟平行制備兩份。培養(yǎng)將取樣金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌芽孢菌的接觸碟倒置于30～35℃培養(yǎng)2天計數(shù)；取樣白色念珠菌的接觸碟倒置于23～28℃培養(yǎng)3天計數(shù)計數(shù)。結果計算計算試驗組和對照組的活菌濃度

（CFU/ml），并換算為對數(shù)值（N），并按下式計算殺滅對數(shù)值:殺滅對數(shù)值

(KL)＝對照組平均活菌濃度的對數(shù)值（NO）－試驗組活菌濃度對數(shù)值（NX）可接受標準殺滅對數(shù)值

(KL)應不低于3~5個對數(shù)單位。表面試驗法記錄見附錄6現(xiàn)場考察試驗消毒前對潔凈區(qū)進行表面微生物取樣。取樣地點：固體車間（D級）的制粒間一墻壁和設備表面、QC微生物檢測室(C級)墻壁和設備表面、QC微生物檢測室超凈工作臺（A級）下設備表面。取樣操作及檢驗執(zhí)行《表面微生物檢驗》。生產操作結束后操作人員按照《生產區(qū)清潔》對潔凈區(qū)進行清潔消毒。清潔消毒完畢15分鐘后，現(xiàn)場QA對清潔消毒后的潔凈區(qū)進行表面微生物取樣。固體車間（D級）的制粒間一墻壁和設備表面、QC微生物檢測室(C級)墻壁和設備表面、QC微生物檢測室超凈工作臺（A級）下設備表面。取樣操作及檢驗執(zhí)行《表面微生物檢驗》。至少進行3次試驗?？山邮軜藴氏竞螅篈級：1CFU/25cm2C級：25CFU/25cm2D級：50CFU