ICS75.160.20CCSE30Determinationofchloramphenicolandmetronidazoleresiduesinporkandbeefbyliquidchromatography-tandemmassspectIT/SATA068—2024前言 2規(guī)范性引用文件 3術語和定義 4原理 5試劑 6儀器 27試樣制備與保存 27.1試樣的的制備 27.2試樣的的保存 28測定步驟 28.1提取 28.2凈化 28.3測定條件 29結(jié)果計算 410測定低限 411精密度和回收率 4附錄A（資料性）氯霉素（CAP）、D5-氯霉素（D5-CAP）、甲硝唑（MDZ）和D4-甲硝唑（D4-MDZ）多反應監(jiān)測（MRM）色譜圖 5附錄B（資料性）氯霉素和甲硝唑在不同基質(zhì)中的平均回收率和精密度 6T/SATA068—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本標準可能涉及某些有危險性的材料、操作和設備，但是并未對與此有關的所有安全問題都提出建議。因此，使用者在應用本標準前應建立適當?shù)陌踩头雷o措施，并確定相關規(guī)章限制的適用性。本文件由深圳市分析測試協(xié)會提出并歸口。本文件起草單位：深圳市龍華區(qū)疾病預防控制中心，深圳市疾病預防控制中心，深圳市南山區(qū)疾病預防控制中心，深圳市羅湖區(qū)疾病預防控制中心。本文件主要起草人：羅蘭，秦威振，王甫，黃承鵬，鐘寶輝，熊韋，任燕，曹赫，林啟輝，劉紅河，姜杰，劉桂華，曾憲東，柳潔，朱波，賴少陽，葉敏。1T/SATA068—2024動物源性食品中氯霉素和甲硝唑殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法本方法適用于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對氯霉素和甲硝唑抗生素殘留量的同時測定。本標準適用于豬、牛、雞、鴨、魚、蝦、貝類中氯霉素和甲硝唑抗生素殘留量的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T5009.1食品衛(wèi)生檢驗方法理化部分總則GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定GB/T22338-2008動物源性食品中氯霉素類藥物殘留測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法GB/T27404實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4原理采用乙酸乙酯提取試樣中氯霉素和甲硝唑藥物殘留，經(jīng)低溫離心，正己烷除油，氮吹、定容后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定目標物，內(nèi)標法定量。5試劑除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。5.1乙酸乙酯（C4H8O2）：色譜純。5.2正己烷（C6H14）：色譜純。5.3乙腈（C2H3N）：色譜純。5.4乙酸銨（C2H7NO2）：色譜純。5.5氫氧化銨（NH3OH，濃度為25%~28%）。5.6無水硫酸鈉（Na2SO4使用前經(jīng)馬弗爐550℃灼燒2h，冷卻后密封保存。5.75mmol/L乙酸銨溶液：稱取0.39g乙酸銨，用水稀釋至1000mL，混勻。CAS:443-48-1）、D4-甲硝唑（C6H5D4N4O3，CAS:1261392-47-5）標準物質(zhì)：純度≥98%5.9標準儲備液：1000mg/mL。分別準確稱取氯霉素、甲硝唑、D5-氯霉素、D4-甲硝唑標準品10.0mg（按照純度示值折算），用甲醇溶解并定容至10mL，配成1000mg/mL的標準儲備液，-20℃以下避光保存，保存期為12個月。5.10混合標準儲備液：分別準確吸取100μL氯霉素、甲硝唑標準儲備液，用甲醇定容至10mL，配成濃度為10mg/L的混合標準儲備液，-20℃以下避光保存，保存期為6個月。2T/SATA068—20245.11混合內(nèi)標儲備液：分別準確量取100μLD5-氯霉素、D4-甲硝唑標準儲備液，用甲醇定容至10mL，配成10mg/L的混合內(nèi)標儲備液，-20℃以下避光保存，保存期為6個月。5.12標準使用液：準確吸取混合標準儲備液50μL，用10%乙腈-水溶液定容至10mL，標準使用液質(zhì)量濃度為0.05mg/L，4℃保存，保存期為7天。5.13內(nèi)標使用液：準確吸取混合內(nèi)標儲備液50μL，用10%乙腈-水溶液定容至10mL，內(nèi)標使用液質(zhì)量濃度為0.05mg/L，4℃保存，保存期為7天。5.14混合標準工作液：分別準確吸取標準使用液5μL、10μL、20μL、50μL、100μL，內(nèi)標使用液各40μL，用10%乙腈-水溶液定容至1.0mL，配制成氯霉素、甲硝唑含量為0.25ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL標準系列，其中內(nèi)標濃度為2ng/mL。臨用現(xiàn)配。6儀器6.1天平：感量為0.01g，0.1mg6.2組織搗碎機6.3渦旋混勻器6.4超聲波清洗器6.5離心機：≥14000r/min6.6氮吹儀6.7氮氣發(fā)生器6.8液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源7試樣制備與保存7.1試樣的的制備取樣品約500g用肉類組織搗碎機絞碎，裝入潔凈容器作為試樣，密封并標明標記。7.2試樣的的保存將試樣于-18℃冰箱中保存。8測定步驟8.1提取稱取5g（精確到0.01g）已經(jīng)均質(zhì)好的樣品于50mL離心管中，加入80μL內(nèi)標標準使用液、15mL乙酸乙酯、0.5mL氫氧化銨、足量的無水硫酸鈉，渦旋混勻，超聲提取30min。在14000r/min，5℃下離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈的離心管中，再在樣品管中加入上述試劑，重復提取一次。合并兩次提取的上清液，于50℃氮氣吹干。8.2凈化將離心管中的殘渣用2mL5%乙腈-水溶液溶解，渦旋30s，超聲1min，加入5mL正己烷，渦旋30s，在14000r/min，5℃離心15min，棄去正己烷，重復操作3次。取水層過0.22μm的尼龍濾膜，收集濾液待上機。8.3測定條件8.3.1液相色譜條件a)色譜柱：C18(十八烷基硅烷，5μm，2.1×150mm)，或相當者；b)流動相：A相5mmol/L的乙酸銨溶液，B相為乙腈。流速為0.3mL/min，梯度洗脫見表1；表1梯度洗脫程序3T/SATA068—2024c)柱溫：40℃;d)進樣量：5μL。8.3.2質(zhì)譜條件a)進樣離子源：ESI源，離子源溫度550℃。b)掃描模式：氯霉素、D5-氯霉素為負離子掃描模式，甲硝唑、D4-甲硝唑為正離子掃描模式。c)監(jiān)測模式：多離子反應監(jiān)測（MRM）。d)噴霧電壓：4.5kV。e)源內(nèi)氣：55psi。f)輔助氣：55psi。g)氣簾氣：30psi。h)其他質(zhì)譜參數(shù)見表2：表2監(jiān)測離子對D-氯霉素D-甲硝唑注：對不同質(zhì)譜儀器，儀器參數(shù)可能存在差異，測定前應將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。8.3.3定性測定將試樣溶液注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，測得其峰面積，以保留時間（偏差在±2.5%之內(nèi)）和監(jiān)測離子的相對豐度比（監(jiān)測離子相對豐度的最大允許偏差見表3）定性。根據(jù)標準曲線得到待測試樣溶液中氯霉素和甲硝唑的質(zhì)量濃度。平行測定次數(shù)不少于兩次。表3定性時相對離子豐度的最大允許偏差8.3.4定量測定在儀器最佳工作條件下，對混合標準工作液（4.16）進樣，以標準溶液中被測組分峰面積和氘代內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標，標準溶液中被測組分濃度與氘代內(nèi)標濃度的比值為橫坐標，繪制標準曲線，用標準曲線對樣品進行定量，樣品溶液中待測物的響應值均應在儀器測定的線性范圍內(nèi)。內(nèi)標法定量。氯霉素（CAP）、D5-氯霉素（D5-CAP）、甲硝唑（MDZ）和D4-甲硝唑（D4-MDZ）的多反應監(jiān)測(MRM)色譜圖參見圖A.1。4T/SATA068—20249結(jié)果計算試樣中各目標化合物的含量按公式（1）計算：式中：X——試樣中目標化合物的含量，單位為微克每千克(μg/kgc——根據(jù)標準曲線計算得到的試樣中目標化合物的濃度，單位為微克每升(μg/Lv——定容體積，單位為毫升（mL）；m——試樣的取用量，單位為克（gf——稀釋倍數(shù)。10測定低限本標準對氯霉素、甲硝唑的測定低限均為0.05μg/kg。11精密度和回收率本標準的精密度數(shù)據(jù)是參考GB/T27404附錄F有關規(guī)定而確定的，參見附錄B。5T/SATA068—2024（資料性）氯霉素（CAP）、D5-氯霉素（D5-CAP）、甲硝唑（MDZ）和D4-甲硝唑（D4-MDZ）多反應監(jiān)測（MRM）色譜圖圖A.1氯霉素（CAP