ICS65.020.20CCSB21

DB63青 海 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB63/T2291—2024青稞育成品種DNA指紋圖譜鑒別規(guī)范2024-6-19發(fā)布 2024-7-25實(shí)施青海省市場監(jiān)督管理局 發(fā)布DB63/T2291DB63/T2291—2024前 言本文件按照GB/T1.1─2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由青海省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：中國科學(xué)院西北高原生物研究所、青海省農(nóng)作物種子站、海南州農(nóng)牧業(yè)綜合服務(wù)中心、青海省鄉(xiāng)村產(chǎn)業(yè)發(fā)展指導(dǎo)中心。本文件由青海省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳監(jiān)督實(shí)施。I標(biāo)準(zhǔn)名稱范圍（Hordeumvulgarevar.nudumHook.f.）DNADNA本文件適用于青稞育成品種DNA指紋圖譜的采集，并對照鑒定。（GB/T3543.2 作種檢驗(yàn)程扦樣GB/T3543.4 作種檢驗(yàn)程發(fā)試GB4404.1 糧作種子第1分禾類GB/T6682 分實(shí)室水規(guī)和驗(yàn)法GB/T19495.3 GB/T30988 DNAGB/T34265 Sanger下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1SNP標(biāo)記基于單核苷酸多態(tài)性的分子標(biāo)記。3.2DNA指紋圖譜通過DNA檢測技術(shù)，獲得由多個(gè)位點(diǎn)上的等位基因組成的長度不等的特征圖紋?？s略語下列縮略語適用于本文件。DNA：脫氧核糖核苷酸（DeoxyribonucleicAcid）SNP：單核苷酸多態(tài)性（SingleNucleotidePolymorphism）1PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）見附錄A。超純水符合GB/T6682的要求，所用試劑為分析純。見附錄B。見附錄C。扦樣GB4404.1GB/T3543.2發(fā)芽按照GB/T3543.4的規(guī)定進(jìn)行發(fā)芽，發(fā)芽的籽粒數(shù)需大于等于50粒。隨機(jī)選取三葉一心植株10株，采取葉片混樣進(jìn)行樣品制備。DNADNA按照GB/T19495.3的方法或采用商用的植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA的提取。DNA按照GB/T30988中的DNA純度、濃度測試進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測。PCR將附錄C中引物稀釋至10μmol/L，DNA濃度稀釋至100ng/μl~200ng/μl。反應(yīng)體系為25μl,包含10×PCR2μl，2.5mmol/LdNTP1.6μl，10μmol/L0.5μl，10μmol/Lμl，TaqDNA0.2μl18.2μl，樣品DNA2μl。294℃預(yù)變性4min；95℃變性30s，不同引物按照附錄C設(shè)置退火溫度退火45s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。按照GB/T30988GB/T34265育成品種DNACSNPDNA參照附錄D中青稞育成品種的DNA圖譜，判斷所鑒定的品種是否為相同或不同的品種。3附 錄 A（規(guī)范性）主要儀器設(shè)備及試劑PCR（0.01（0.0001g、μl、10μl、100μl、1000μl）、微波爐、量筒、電泳裝置、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)或紫外乙二胺四乙酸二納、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、十六烷基三甲基溴化銨、β-巰基乙醇、Tris-飽和酚、三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇、10×PCR反應(yīng)緩沖液、4種脫氧核糖核苷酸、TaqDNA聚合酶、瓊脂糖、溴酚藍(lán)、硼酸、二甲苯青、甘油、二甲基腈藍(lán)FF、溴化乙錠。4附 錄 B（規(guī)范性）溶液配制DNA0.5ol/A（H.0溶液稱取9.305g的EDTA-Na2·2H2O，加40mL0.8g～1.1gNaOHpH至8.0，50ml103.4kPa（121℃）20min1ol/rs-C（H80）稱取6.06g的Tris，加40mL的超純水，充分溶解。用1.8mL～2.2mL的濃HCl（36%~38%）準(zhǔn)確調(diào)節(jié)pH至8.0，定容至50ml。滅菌溫度和時(shí)間同B.1.1，室溫保存。DNA稱取十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）8g和氯化鈉32.7g，依次加入10mLTris-HCl溶液（pH8.0）（見B.1.2），4mLEDTA溶液（pH8.0）（見B.1.1），加超純水充分溶解后定容至400mL。滅菌溫度和時(shí)間同B.1.1，4℃保存。10DNA取10mL1mol/LTris-HCl溶液（pH8.0）（見B.1.2）和2mL0.5mol/LEDTA溶液（pH8.0）（見B.1.1）100mlB.1.1，5×TBE稱取54gTris，27.5g20ml0.5mol/LEDTA見B.1.1）1L。1×TBE6×稱取EDTA8.7672g，二甲苯腈藍(lán)FF0.5g，溴酚藍(lán)0.5g，加入360ml甘油，調(diào)節(jié)PH至7.0，再用超純水定容至1L，磁力攪拌溶解，4℃保存。10mg/ml（EB）在100ml超純水中加入1g溴化乙錠，磁力攪拌數(shù)小時(shí)確保其完全溶解，棕色瓶室溫保存。5附 錄 C（）SNPSNP標(biāo)記信息見表C.1。表C.1 用于建稞成種DNA紋的SNP標(biāo)物信息標(biāo)記染色體位置(bp)退火溫度（℃）引物序列（5’-3’）SNP17H61021878858F:GCGAGGTGGACGATGTGGR:GTGAGTTTGACGAGGTTCTGCSNP27H7932520158F:CAGTCCACGTCCCACCAAAR:TGCAAGCGTCGTCATCCTCSNP37H552552555F:CCGCAGTATCATTCAGTCCR:GGTTCTCCTCAGGTCCAGTSNP46H54689193657F:GACACCGGCATGGACATTTTR:TCGAGTCGAAGCTCCACAGGSNP55H62016306057.5F:TTGGTCCAATAGTTCGGCGGR:CGGTGTAGTCGGAGACGATGSNP65H65031020256F:CACGCCAAGTGCTTCAGAR:ACCGCAAGGATAGTAGACAGGSNP75H62017496055F:GGCCATCGACATCAGCAAR:CCACCTCCCATTCTTCCAGSNP83H60241762956.5F:CGATGACGATGCCCTTTGR:GCCGTGAACCGCTCTTGTSNP92H76286357352.5F:GAGATTTCAGCAGCCCAGAT