??????????????無(wú)論您是剛接觸細(xì)胞治療生產(chǎn),還是希望擴(kuò)大現(xiàn)有工藝和知識(shí)庫(kù),本指南都將為您提供成功生產(chǎn)細(xì)胞治療產(chǎn)品的主要注??1.細(xì)胞治療所需生產(chǎn)原材料的注意事項(xiàng)2.供應(yīng)商資格認(rèn)定過(guò)程概述4.細(xì)胞分離5.細(xì)胞改造6.細(xì)胞擴(kuò)增7.用于細(xì)胞治療的自動(dòng)化封閉系統(tǒng)8.細(xì)胞治療的特性研究和分析9.影響細(xì)胞治療產(chǎn)品低溫保存的因素第1節(jié):簡(jiǎn)介在細(xì)胞治療產(chǎn)品轉(zhuǎn)化至臨床的過(guò)程中,決定成功的因素在于影響生產(chǎn)的早期工藝和材料選擇上的決策。不僅是最終獲批藥品中的材料(即輔料)需要滿足—定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),而且生產(chǎn)過(guò)程中使用的原材料(或輔助材料)也必須符合嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。如果產(chǎn)品開發(fā)初期選擇的原材料在臨床試驗(yàn)和商業(yè)化階段不能滿足必要的監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn),就需要用符合標(biāo)準(zhǔn)的材料來(lái)替代。這些替代品可能會(huì)導(dǎo)致成本和時(shí)間的大幅增加。要想取得細(xì)胞治療臨床試驗(yàn)和商業(yè)化的成功,最佳做法是:制定—個(gè)以最終目標(biāo)為導(dǎo)向的原材料戰(zhàn)略。這種考量更長(zhǎng)遠(yuǎn),側(cè)重于在細(xì)胞治療產(chǎn)品開發(fā)早期就使用更高等級(jí)的原材料,以滿足臨床試驗(yàn)的必要監(jiān)管條件,并最終實(shí)現(xiàn)獲批治療產(chǎn)品的商業(yè)化生產(chǎn)。該策略能夠增加成功概率,避免突發(fā)的代價(jià)高昂的意外,導(dǎo)致錯(cuò)過(guò)有前景的細(xì)胞治療候選方案。本節(jié)高度概述了原材料選擇的注意事項(xiàng),以降低風(fēng)險(xiǎn)并符合當(dāng)前的監(jiān)管指南。有關(guān)這—主題的更深入討論,請(qǐng)參見(jiàn)本節(jié)什么是原材料原材料,在美國(guó)法規(guī)中也被稱為輔助材料*,是指在生產(chǎn)過(guò)程中與細(xì)胞治療產(chǎn)品接觸,但不保留在最終治療產(chǎn)品中的成分。例如,細(xì)胞培養(yǎng)基和生長(zhǎng)因子是生產(chǎn)細(xì)胞治療產(chǎn)品時(shí)采用的原材料。雖然最終產(chǎn)品中沒(méi)有原材料,但原材料仍然很重要,因?yàn)樗鼈兛赡軐?duì)最終細(xì)胞治療產(chǎn)品的安全性、純度和效價(jià)有影響。按中國(guó)《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(2010年修訂)》中第三百—十二條第三十五條對(duì)物料的定義,生物制品的原料是指原材料。同時(shí),在中國(guó)藥典2020版第三部《生物制品通則-生物制品生產(chǎn)用原材料及輔料質(zhì)量控制》中規(guī)定,對(duì)于生物制品生產(chǎn)用原材料系指生物制品生產(chǎn)過(guò)程中使用的所有生物原材料和化學(xué)原材料。按照來(lái)源可將生物制品生產(chǎn)用原材料分為兩大類:—類為生物原材料,主要包括來(lái)源于微生物,人和動(dòng)物細(xì)胞、組織、體液成分,以及采用重組技術(shù)或生物合成技術(shù)生產(chǎn)的生物原材料等;另—類為化學(xué)原材料,包括無(wú)機(jī)和有機(jī)化學(xué)材料?！銇?lái)說(shuō),原材料不屬于監(jiān)管產(chǎn)品。然而,監(jiān)管指南建議開發(fā)者盡可能使用治療級(jí)原材料,因?yàn)樗鼈儗?duì)最終細(xì)胞治療產(chǎn)品的特性和安全性有潛在影響。不幸的是,并不是每種使用到的原材料都有治療級(jí)版本。因此,最好選擇根據(jù)適當(dāng)?shù)默F(xiàn)行生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(cGMP)生產(chǎn)的原材料。雖然有針對(duì)僅供研究使用(RUO)和體外診斷(IVD)使用開發(fā)的相同材料,但特別是當(dāng)治療產(chǎn)品進(jìn)入到臨床試驗(yàn)并有望實(shí)現(xiàn)商業(yè)化時(shí),這類材料往往缺乏—些必要的溯源記錄和測(cè)試。在長(zhǎng)期細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中,應(yīng)避免使用為RUO或IVD用途設(shè)計(jì)的原材料。與藥品和醫(yī)療器械不同的是,沒(méi)有針對(duì)原材料生產(chǎn)的特定cGMP指南。監(jiān)管指南(如USP<1043>和ISO276)僅僅建議選擇根據(jù)適當(dāng)質(zhì)量管理體系生產(chǎn)的原材料,這是—個(gè)相當(dāng)模糊的術(shù)語(yǔ)。供應(yīng)商可能聲稱他們的產(chǎn)品是在cGMP條件下生產(chǎn)的,此類聲明包括:基于遵循特定cGMP指南的cGMP聲明;獨(dú)立的質(zhì)量管理體系認(rèn)證(如ISO9001);或者如果該工廠生產(chǎn)的是受監(jiān)管的產(chǎn)品,甚至可能聲稱經(jīng)過(guò)監(jiān)管機(jī)構(gòu)的檢查。然而,根本沒(méi)有所謂的“GMP級(jí)”材料。要了解按照cGMP生產(chǎn)原材料的含義,首先要從已發(fā)布的監(jiān)管指南開始。表1列出了不同地區(qū)的—些主要指南。日本、歐洲和美國(guó)有最詳細(xì)的原材料指南,其中日本是最嚴(yán)格的。*不同地區(qū)對(duì)“原材料”和“輔助材料”這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)可能存在—些混淆——?dú)W洲使用“原材料”—詞,而美國(guó)使用“輔助材料”—詞。輔助材料與美國(guó)聯(lián)邦法規(guī)第21篇第1271部分中定義的“加工材料”和美國(guó)現(xiàn)行藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范第211部分中定義的“成分”同義。1.??????????ǎ?????????????WHO生物制品GMP?各種ISO標(biāo)準(zhǔn)(ISO9001、13485和TC276)?各種ICH指南(ICHQ5A、ICHQ5D、ICHQ3、ICHQ2)。?????澳大利亞生物制劑監(jiān)管指南(ARGB)—用于生產(chǎn)的關(guān)鍵原材料???PMDAMHLW第210號(hào)公告—生物成分標(biāo)準(zhǔn)?可用的原材料認(rèn)證流程???(EC)第1394/2007號(hào)ATMP法規(guī)?歐洲藥典5.2.12用于生產(chǎn)細(xì)胞和基因治療藥物的生物源性原材料?歐盟藥事法規(guī)第4卷GMP指南(2018年5月)??USP<1043>—用于細(xì)胞、基因和組織工程產(chǎn)品的輔助材料?USP<92>—用于細(xì)胞治療生產(chǎn)的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子(限于rh-IL4)?FDA化學(xué)、制造和控制(CMC)指南?美國(guó)聯(lián)邦法規(guī)第21卷第1271部分第1271.210節(jié)-GTP?美國(guó)聯(lián)邦法規(guī)第21卷第211部分E子部分—GMP?可用的主文件流程???中國(guó)藥典第三部《生物制品生產(chǎn)用原材料及輔料質(zhì)量控制規(guī)程》?《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(2010年修訂)》?《人用基因治療制品總論(公示稿)》?《CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品質(zhì)量控制檢測(cè)研究及非臨床研究考慮要點(diǎn)》?《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范-細(xì)胞治療產(chǎn)品附錄(征求意見(jiàn)稿)》—般而言,cGMP是指“在生產(chǎn)、加工和包裝制劑時(shí)所使用的方法、設(shè)施和控制的最低要求”,以確保該產(chǎn)品是安全的,并具有正確的效價(jià)和成分。這些通用的cGMP要求包括:人員規(guī)范;質(zhì)量控制計(jì)劃和功能;設(shè)施和設(shè)備;組件、容器和封閉系統(tǒng)的控制;生產(chǎn)和記錄;實(shí)驗(yàn)室控制;包裝、標(biāo)簽和分銷;以及記錄保存。要求示例見(jiàn)表2。表2.cGMP生產(chǎn)基本組成示例。系統(tǒng)示例系統(tǒng)材料控制倉(cāng)庫(kù)中來(lái)料的檢疫和放行過(guò)程材料控制GMP分析有質(zhì)量保證監(jiān)督的質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程具有偏差及糾正和預(yù)防措施(CAPA)過(guò)程的批記錄文件合格操作者必要的著裝、安全和操作培訓(xùn)有環(huán)境控制的受控訪問(wèn)鍵控訪問(wèn)ISO7級(jí)環(huán)境,并有ISO5級(jí)空間用于無(wú)菌處理環(huán)境監(jiān)測(cè)和清潔周期滴板、拭子測(cè)試、顆粒監(jiān)測(cè)以及定期消毒和清潔USP<1043>是全球最受認(rèn)可的原材料指導(dǎo)文件之—。USP<1043>提出了—個(gè)基于4個(gè)風(fēng)險(xiǎn)類別的風(fēng)險(xiǎn)模型,用于評(píng)估每種原材料(表3)。這些風(fēng)險(xiǎn)類別由生產(chǎn)商要求的具體活動(dòng)來(lái)定義。每個(gè)風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)所需的活動(dòng)是分階段進(jìn)行的,所有產(chǎn)品都需要—個(gè)子集(例如,分析證書和批間測(cè)試)。隨著與原材料相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)的增加,還需要進(jìn)行不同的活動(dòng)(例如,對(duì)含有動(dòng)物產(chǎn)品的殘留材料進(jìn)行安全測(cè)試)。產(chǎn)品進(jìn)入臨床試驗(yàn)后期時(shí),風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)隨之增加。產(chǎn)品開發(fā)者應(yīng)著眼于獲取1級(jí)和2級(jí)原材料;3級(jí)原材料不太有利;臨床工作應(yīng)避免使用4級(jí)原材料。鑒于做不到零風(fēng)險(xiǎn),開發(fā)者在選擇原材料時(shí)要力圖保持盡可能低的風(fēng)險(xiǎn),同時(shí)還要保持性能。表3.USP<1043>原材料風(fēng)險(xiǎn)類別。*CGT=細(xì)胞和基因治療層級(jí)風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)說(shuō)明示例用作細(xì)胞培養(yǎng)基添加劑的注射用重組人胰島素1最低高質(zhì)量并適合CGT*的生產(chǎn)2低層級(jí)風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)說(shuō)明示例用作細(xì)胞培養(yǎng)基添加劑的注射用重組人胰島素1最低高質(zhì)量并適合CGT*的生產(chǎn)2低特性鑒定良好,預(yù)期用作原材料,在符合GMP的質(zhì)量管理體系下生產(chǎn)GibcoCTS培養(yǎng)基和試劑產(chǎn)品預(yù)期不作為原材料使用RUO或IVD材料,如—些細(xì)胞培養(yǎng)基4高未在公認(rèn)的質(zhì)量管理體系下生產(chǎn),預(yù)期不作為原材料使用;可能來(lái)自動(dòng)物,有毒,生物活性不穩(wěn)定動(dòng)物細(xì)胞或動(dòng)物血清,用于細(xì)胞培養(yǎng)的霍亂毒素,或用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的選擇劑表4中國(guó)藥典2020版對(duì)不同風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)生物制品生產(chǎn)用原材料的質(zhì)量控制要求原材料等級(jí)第1級(jí)上市許可證明(如藥品注冊(cè)產(chǎn)許可證)√供應(yīng)商藥品生產(chǎn)GMP證書√供應(yīng)商出廠檢驗(yàn)報(bào)告√國(guó)家批簽發(fā)合格證如有應(yīng)供應(yīng)按照國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)或生物制品生產(chǎn)企業(yè)內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)全檢—關(guān)鍵項(xiàng)目檢測(cè)(如鑒常毒性檢查等)√外源因子檢查—進(jìn)一步純化—來(lái)源證明—符合原廠國(guó)和中國(guó)相關(guān)動(dòng)物源性疾病的安全性要求,包括TSE—供應(yīng)商審計(jì)√第2級(jí)√√√—抽檢(批)√————√第3級(jí)——√—√——如需要——√第4級(jí)——√—√—?jiǎng)游镌牧蠎?yīng)檢測(cè)如需要?jiǎng)游镌牧蠎?yīng)提供動(dòng)物原材料應(yīng)提供√注:“√”為對(duì)每批原材料使用前的質(zhì)控要求;“—”為不要求項(xiàng)目。在中國(guó)藥典中規(guī)定,對(duì)于不同風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別原材料的質(zhì)量控制,應(yīng)充分考慮來(lái)源于動(dòng)物(或人)的生物原材料可能帶來(lái)的外源因子污染的安全性風(fēng)險(xiǎn)。生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)避免使用毒性較大的化學(xué)原材料,有機(jī)溶劑的使用應(yīng)符合藥典通則“殘留溶劑測(cè)定法”的相關(guān)要求。中國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局在2022年1月發(fā)布的《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范-細(xì)胞治療產(chǎn)品附錄(征求意見(jiàn)稿)》中對(duì)細(xì)胞治療的物料進(jìn)行了規(guī)定,如第二十六條【原材料控制】細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)用的生物材料,如細(xì)胞株、工程菌、載體、動(dòng)物來(lái)源的試劑和血清等,企業(yè)應(yīng)當(dāng)保證其來(lái)源合法、安全并符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),防止引入或傳播傳染病病原體。同時(shí),在第二十七條【關(guān)鍵物料】中規(guī)定,企業(yè)應(yīng)當(dāng)對(duì)物料進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,以確定關(guān)鍵物料(如直接用于細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)的基因修飾載體或其他起始生物材料、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、酶、血清等),關(guān)鍵物料的確定應(yīng)當(dāng)有記錄。對(duì)關(guān)鍵物料應(yīng)開展入廠檢驗(yàn),并考慮特定風(fēng)險(xiǎn)及降低風(fēng)險(xiǎn)的其他措施(如加強(qiáng)質(zhì)量控制)。對(duì)于在細(xì)胞治療生產(chǎn)與檢測(cè)過(guò)程中使用的體外診斷試劑,在此意見(jiàn)稿的第二十八條進(jìn)行了相關(guān)規(guī)定,即用于特定傳染病病原體(HIV、HBV、HCV及梅毒螺旋體)標(biāo)記檢查的體外診斷試劑及其管理,應(yīng)采用經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)的體外診斷試劑。細(xì)胞治療生產(chǎn)中原材料的關(guān)鍵質(zhì)量屬性選擇生產(chǎn)細(xì)胞治療產(chǎn)品的原材料時(shí),開發(fā)者通常關(guān)注四個(gè)關(guān)鍵的產(chǎn)品特性:?材料身份鑒別?純度,以及是否有雜質(zhì)?批間—致性?儲(chǔ)存和穩(wěn)定性表5總結(jié)了針對(duì)每個(gè)特征要考慮的—些重要細(xì)節(jié)。由于關(guān)鍵質(zhì)量屬性缺乏全球標(biāo)準(zhǔn),細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)商會(huì)選擇符合該地區(qū)最嚴(yán)格要求的標(biāo)準(zhǔn)的原材料。就材料身份鑒別來(lái)看,細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)商應(yīng)密切注意生物安全特性,以確定材料可能給設(shè)施、操作者和最終細(xì)胞治療產(chǎn)品帶來(lái)的任何風(fēng)險(xiǎn)。最好盡可能避免動(dòng)物源性成分。如果無(wú)法做到這—點(diǎn),那對(duì)這些原材料采取基于風(fēng)險(xiǎn)的方法進(jìn)行分析就非常重要。在這個(gè)過(guò)程中需要考慮到以下因素:?可能的替代品(例如,重組蛋白)?病毒滅活過(guò)程?上游與下游使用(越往下游使用原料產(chǎn)品,風(fēng)險(xiǎn)越大)?材料等級(jí)(例如,符合cGMPvsRUO)。?經(jīng)證實(shí)的產(chǎn)品可追溯性和文件(來(lái)自供應(yīng)商)。?原產(chǎn)國(guó)(對(duì)CJD、BSE和TSE風(fēng)險(xiǎn)很重要)。表5.四種關(guān)鍵原材料特性的考慮因素。特性考慮因素特性?關(guān)于分子組成或配方的所有信息?對(duì)于專有材料,關(guān)于活性組分活性的文件??關(guān)于分子組成或配方的所有信息?對(duì)于專有材料,關(guān)于活性組分活性的文件?動(dòng)物源性材料的COO、健康聲明和病原體檢測(cè)?所需的病毒檢測(cè)、供體資格和篩選、人源材料的文件身份鑒別和無(wú)微生物或病毒污染?關(guān)于純度的文件?對(duì)于多組分產(chǎn)品,活性成分的純度?雜質(zhì)的鑒定應(yīng)記錄在案?檢測(cè)殘留物的方法一致性?供應(yīng)商努力在分析證書上體現(xiàn)批間—致性?按照GMP生產(chǎn)的材料更容易證明—致性儲(chǔ)存和穩(wěn)定性?供應(yīng)商建議的儲(chǔ)存條件(如溫度、光線、濕度),證明原材料保持穩(wěn)定性能?由穩(wěn)定性測(cè)試支持的產(chǎn)品貨架期,反映產(chǎn)品作為原材料的使用情況純度和雜質(zhì)在生物安全領(lǐng)域內(nèi),有—些術(shù)語(yǔ)在使用上可能會(huì)產(chǎn)生混淆。在選擇所涉原材料時(shí),細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)商應(yīng)明確了解供應(yīng)以充分了解與原材料有關(guān)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)商在做出最終材料決策時(shí),還需要考慮原材料的性能測(cè)試。供應(yīng)商應(yīng)提供性能數(shù)據(jù),以反映產(chǎn)品作為原材料的預(yù)期用途。例如,使用CHO細(xì)胞系對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行性能測(cè)試時(shí),如果培養(yǎng)基的預(yù)期用途是生長(zhǎng)T細(xì)胞,那么這種測(cè)試就沒(méi)有什么用處。數(shù)據(jù)還應(yīng)能夠使開發(fā)者確定原材料的性能—致性,定量數(shù)據(jù)優(yōu)于通過(guò)/未通過(guò)結(jié)果。為了準(zhǔn)確評(píng)估數(shù)據(jù)并確定其與預(yù)期用途的相關(guān)性,供應(yīng)商應(yīng)提供所使用的測(cè)定方法,最好是使用參考測(cè)試方法(如美國(guó)藥典或USP)。開發(fā)者應(yīng)盡可能選擇有各論的USP級(jí)或EP級(jí)等藥品級(jí)原材料。各論確保原材料符合由特定測(cè)試、操作步驟和接受標(biāo)準(zhǔn)確定的特定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),包括身份鑒別、強(qiáng)度、質(zhì)量和純度。如果沒(méi)有各論,則應(yīng)在供應(yīng)商的材料文件(見(jiàn)下文,關(guān)鍵原材料文件)中找到—些(如果不是全部的話)上文討論的重要屬性信息。但是,開發(fā)者可能需要進(jìn)行額外的測(cè)試,以便最終做出穩(wěn)妥決策,并降低與原材料相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)。即使不存在全球質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),生產(chǎn)商最好選擇經(jīng)過(guò)充分特性鑒定的原材料,以確定與之相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn),包括:?分析證書上測(cè)試方法的數(shù)值規(guī)范,以證明批間—致性?側(cè)重于生產(chǎn)過(guò)程中預(yù)期用途的性能測(cè)試,并將穩(wěn)定性測(cè)試與性能掛鉤?原產(chǎn)地證書上提供的生物衍生原材料在—級(jí)、二級(jí)和三級(jí)水平上的可追溯性?使用USP測(cè)試方法或經(jīng)過(guò)確認(rèn)的內(nèi)部方法,并在分析證書上報(bào)告關(guān)鍵原材料文件上述關(guān)于原材料質(zhì)量屬性的大部分信息都可以在各種供應(yīng)商文件中找到(表6,圖1)。這些不同文件中的信息除了用于確定原材料是否適合細(xì)胞治療生產(chǎn)外,其中—些信息也是各種監(jiān)管備案文件所需信息。在原材料含有專利組分或配方的情況下,開發(fā)者應(yīng)尋找能夠通過(guò)法規(guī)支持文件提供此類信息的供應(yīng)商,這些文件根據(jù)簽署的保密協(xié)議提供?！┑貐^(qū)(如美國(guó))支持由供應(yīng)商提供的主文件,以便與相應(yīng)的監(jiān)管機(jī)構(gòu)共享專有材料。主文件不需要簽署保密協(xié)議,可以更快獲得監(jiān)管備案的必要信息。?GMP生產(chǎn)(美國(guó)聯(lián)邦法規(guī)第21篇第820部分,經(jīng)ISO13485認(rèn)證)?詳細(xì)的分析證書(COA)和原產(chǎn)地證書(COO)?藥物主文件(DMF)或法規(guī)支持文件(RSF)?無(wú)菌產(chǎn)品(經(jīng)確認(rèn)的SAL10-3)?內(nèi)毒素和支原體檢測(cè)?性能測(cè)試(T細(xì)胞功能檢測(cè))?人源蛋白的外源病毒檢測(cè)和病毒滅活數(shù)據(jù)的獲取?在細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)中久經(jīng)驗(yàn)證圖1.細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)商在各種產(chǎn)品文件中應(yīng)查找的重要產(chǎn)品特性示例。例如,Gibco?CTS?免疫細(xì)胞血清替代品是專門設(shè)計(jì)用于細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)的試劑,符合文件要求。它符合美國(guó)、歐洲和日本的原材料指南。進(jìn)行人類淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí),該試劑旨在替代在人血清。表6.原材料供應(yīng)商文件類型。文件類型說(shuō)明分析證書(COA)COA包含產(chǎn)品批次信息;產(chǎn)品貨架期和失效期信息;身份鑒別信息;數(shù)量信息;純度和雜質(zhì)信息;安全性信息和生物活性等信息。原產(chǎn)地證書(COO)COO證明了供應(yīng)鏈控制(可追溯性),這對(duì)人源性和動(dòng)物源性產(chǎn)品尤為重要。安全資料表(SDS)SDS(如適用)包含了每種材料的特性及其物理、健康和環(huán)境危害等信息,以及與之相關(guān)的后續(xù)防護(hù)措施,還包括處理、儲(chǔ)存和運(yùn)輸材料的必要安全預(yù)防措施。符合性證書(CoC)COC可用于支持質(zhì)量體系或標(biāo)準(zhǔn)的合規(guī)性聲明。法規(guī)支持文件(RSF)根據(jù)保密協(xié)議,該總結(jié)提供產(chǎn)品性能、穩(wěn)定性、質(zhì)量控制和分析測(cè)試方法,專門用于滿足細(xì)胞治療產(chǎn)品原材料監(jiān)管要求。當(dāng)主文件不可用時(shí)使用。藥物主文件(DMF)向監(jiān)管機(jī)構(gòu)提交的—份詳細(xì)的文件,提供有關(guān)生產(chǎn)、測(cè)試、加工、包裝和儲(chǔ)存所用的設(shè)施、工藝和原材料的機(jī)密信息。DMF僅在美國(guó)、加拿大和日本可用。供應(yīng)商和開發(fā)者的責(zé)任最終,藥物生產(chǎn)商有責(zé)任評(píng)估與所選原材料相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)和適用性,其中大部分評(píng)估是在供應(yīng)商資格認(rèn)定過(guò)程中進(jìn)行的(關(guān)于供應(yīng)商資格認(rèn)定的更多內(nèi)容,請(qǐng)閱讀下文)。表7提供了在此過(guò)程中需要解決的—些重要事項(xiàng),以減少與細(xì)胞治療產(chǎn)品相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)。表7.原材料風(fēng)險(xiǎn)評(píng)定的一些關(guān)鍵考慮因素。原材料:考慮因素來(lái)源?這種材料是人源、動(dòng)物源還是重組材料??來(lái)源涉及病毒嗎??該材料可以用低風(fēng)險(xiǎn)的替代品來(lái)替代嗎?生產(chǎn)?非專用設(shè)施中的cGMP、無(wú)菌和交叉污染問(wèn)題是什么??在生產(chǎn)過(guò)程中,材料是否有可能接觸到其他人類和動(dòng)物產(chǎn)品??供應(yīng)商的生產(chǎn)場(chǎng)地是否經(jīng)過(guò)了我司團(tuán)隊(duì)的審計(jì)審計(jì)?測(cè)試?有哪些測(cè)試可以證明該材料的特性、純度、安全性和性能??是否進(jìn)行過(guò)任何病毒滅活處理?是否經(jīng)過(guò)確認(rèn)?可追溯性?供應(yīng)商能否證明所有風(fēng)險(xiǎn)組分及其供應(yīng)鏈的材料可追溯性?原材料供應(yīng)商在選擇過(guò)程中以及選擇之后也有義務(wù)。細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)商和原材料供應(yīng)商了解各自在整個(gè)臨床試驗(yàn)和商業(yè)化過(guò)程中的責(zé)任,并共同努力,及時(shí)履行這些責(zé)任,這—點(diǎn)很重要(表8)。表8.細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)商及其供應(yīng)商的責(zé)任?；顒?dòng)生產(chǎn)商供應(yīng)商針對(duì)預(yù)期用途鑒定原材料的性能提供原材料的提供原材料的COA、COO和SDS確保原材料在人類和動(dòng)物疾病方面是安全的確保原材料在人類和動(dòng)物疾病方面是安全的對(duì)用于細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)的原材料進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)定確認(rèn)對(duì)最終細(xì)胞治療產(chǎn)品至關(guān)重要的COA測(cè)試對(duì)原材料進(jìn)行特性鑒定并制定規(guī)范評(píng)估最終細(xì)胞治療產(chǎn)品原材料的批間差異確定生物相容性、細(xì)胞毒性和其他安全性測(cè)試(如果供應(yīng)商沒(méi)有提供)評(píng)估最終細(xì)胞治療產(chǎn)品中殘留的原材料評(píng)估原材料的穩(wěn)定性準(zhǔn)備法規(guī)支持文件(主文件或RSF)執(zhí)行質(zhì)量和供應(yīng)協(xié)議對(duì)于細(xì)胞治療而言,除—般性的生物原材料與化學(xué)原材料外,還涉及較為特殊的供者材料:依據(jù)《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范-細(xì)胞治療產(chǎn)品附錄(征求意見(jiàn)稿)》第十五條【供者篩查標(biāo)準(zhǔn)和供者材料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)】,企業(yè)應(yīng)當(dāng)根據(jù)細(xì)胞產(chǎn)品注冊(cè)批準(zhǔn)的要求建立供者篩查標(biāo)準(zhǔn)和供者材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),并綜合考慮微生物的生物安全等級(jí)、傳染病類別和細(xì)胞產(chǎn)品的預(yù)定用途等因素進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,定期回顧其適用性。在采集供者材料前,應(yīng)依據(jù)第二十—條【采集操作規(guī)程】,制訂供者材料采集、運(yùn)輸、接收的書面要求,并詳細(xì)說(shuō)明供者材料的采集方法、保存和運(yùn)輸條件以及接收的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)負(fù)責(zé)供者材料采集的醫(yī)療機(jī)構(gòu),企業(yè)應(yīng)根據(jù)第十六條~第二十條,選擇具有合法資質(zhì)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)作為供者材料采集的機(jī)構(gòu),對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估與審計(jì),同時(shí)確定經(jīng)認(rèn)可的合格醫(yī)療機(jī)構(gòu)名單,建立對(duì)應(yīng)的質(zhì)量檔案,簽訂對(duì)應(yīng)的質(zhì)量協(xié)議,并定期對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)采集供者材料的情況進(jìn)行回顧與評(píng)估。對(duì)于每批供者材料,企業(yè)應(yīng)按第二十四條【質(zhì)量評(píng)價(jià)】,在投產(chǎn)前,對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià),內(nèi)容至少應(yīng)包括:(—)確認(rèn)供者材料來(lái)自于合法的且經(jīng)過(guò)企業(yè)評(píng)估批準(zhǔn)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)及符合篩查標(biāo)準(zhǔn)的供者,并按照第二十—條【采集操作規(guī)程】?jī)?nèi)容核對(duì)相關(guān)信息;(二)運(yùn)輸過(guò)程中的溫度監(jiān)控記錄完整,溫度符合規(guī)定要求;如對(duì)供者材料采集后的儲(chǔ)存溫度有特殊要求,還應(yīng)有完整的溫度監(jiān)控記錄,且符合標(biāo)準(zhǔn)要求;(三)供者材料從醫(yī)療機(jī)構(gòu)采集結(jié)束至企業(yè)放行用于生產(chǎn)前的儲(chǔ)存溫度和時(shí)限符合規(guī)定要求;(四)供者材料包裝完整,無(wú)破損;(五)運(yùn)輸、儲(chǔ)存過(guò)程中出現(xiàn)的偏差已按相關(guān)規(guī)程進(jìn)行調(diào)查和處理。對(duì)于細(xì)胞治療中涉及的傳染病陽(yáng)性的供者材料,企業(yè)應(yīng)參照第二十三條【陽(yáng)性供者材料】進(jìn)行隔離存放,且每個(gè)包裝都有明顯標(biāo)識(shí)。意見(jiàn)稿中同時(shí)規(guī)定,企業(yè)不得接受不符合注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)的異體供者材料?？偨Y(jié)選擇用于細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)原材料時(shí),存在許多監(jiān)管方面的挑戰(zhàn)。目前還沒(méi)有—個(gè)全球標(biāo)準(zhǔn)可以囊括細(xì)胞治療產(chǎn)品中所用原材料的所有關(guān)鍵屬性,因此難以覆蓋可能使用該藥物的所有區(qū)域。同時(shí),也沒(méi)有特定cGMP指南可用于生產(chǎn)細(xì)胞治療產(chǎn)品中使用的原材料,并且所用術(shù)語(yǔ)存在混淆,這使得確定合適的供應(yīng)商的過(guò)程更加繁重。這些挑戰(zhàn)給開發(fā)者帶來(lái)了更大的壓力,他們需要確定—種策略,在降低風(fēng)險(xiǎn)的同時(shí),能夠平衡原材料的成本和性能。這種策略的制定應(yīng)著眼于長(zhǎng)遠(yuǎn),避免在臨床開發(fā)和試驗(yàn)后期需要替換原材料。例如開發(fā)—種滿足其目標(biāo)地區(qū)最嚴(yán)格監(jiān)管要求的產(chǎn)品。細(xì)胞治療產(chǎn)品的成分對(duì)開發(fā)—個(gè)可重復(fù)且穩(wěn)健的生產(chǎn)過(guò)程至關(guān)重要。在細(xì)胞治療產(chǎn)品開發(fā)早期,從專門生產(chǎn)細(xì)胞治療用產(chǎn)品的可靠供應(yīng)商處適當(dāng)采購(gòu)材料,可以縮短開發(fā)時(shí)間,大大降低成本,并提高獲得監(jiān)管當(dāng)局批準(zhǔn)的可能性。其他資源本文概述了細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)商在選擇適當(dāng)?shù)脑牧蠒r(shí)必須應(yīng)對(duì)的眾多挑戰(zhàn)和考慮因素。要對(duì)這些主題進(jìn)行更深入的討論,我們推薦觀看多能細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn),一個(gè)關(guān)于細(xì)胞和基因療法生產(chǎn)用GMP輔助材料的網(wǎng)絡(luò)研討會(huì)點(diǎn)播視頻,以及來(lái)自各種監(jiān)管機(jī)構(gòu)的大量出版物,包括:?歐洲藥典5.2.12用于生產(chǎn)細(xì)胞和基因療法醫(yī)藥產(chǎn)品的生物源性原材料?USP<1046>基于細(xì)胞和組織的產(chǎn)品?USP<1047>基因療法產(chǎn)品?USP<1043>輔助材料?USP<1024>牛血清?USP<90>胎牛血清?USP<89>用作輔助材料的酶?USP<92>生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子?日本的生物成分標(biāo)準(zhǔn)+?ISO工作草案—細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中的輔助材料?中國(guó)藥典第三部《生物制品生產(chǎn)用原材料及輔料質(zhì)量控制規(guī)程》?《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范-細(xì)胞治療產(chǎn)品附錄(征求意見(jiàn)稿)Scientific(2020)Scientific(2020)Manufacturingpluripotentcell1.ThermoFishertherapeuticstates2.USP(2006)GeneralChapter<1043>:AncillaryMaterialsforCell-andTissue-BasedProducts.In:USP-NFEnglishEdition.Rockville:UnitedStatesPharmacopeialConvention.tates本文件所述產(chǎn)品的預(yù)期用途各不相同。具體預(yù)期用途聲明請(qǐng)參閱使用說(shuō)明書(IFU)。第2節(jié):簡(jiǎn)介供應(yīng)商資格認(rèn)定(VQ)是確定供應(yīng)商是否有能力滿足必要產(chǎn)品或服務(wù)的特定要求的過(guò)程。對(duì)于細(xì)胞治療產(chǎn)品的生產(chǎn),必要的產(chǎn)品和服務(wù)涵蓋范圍廣泛,包括原材料選擇、無(wú)菌灌配送。VQ過(guò)程告知所有參與方,產(chǎn)品和服務(wù)符合身份鑒別、質(zhì)量和純度的接受標(biāo)準(zhǔn),并保證產(chǎn)品和服務(wù)始終符合指定的GMP要求。細(xì)胞治療行業(yè)正處于初期階段,目前關(guān)于VQ的標(biāo)準(zhǔn)化監(jiān)管政策或指南還很少。不過(guò),大多數(shù)生產(chǎn)實(shí)體(申辦方、合同開發(fā)和生產(chǎn)組織)遵守FDA、人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)(ICHE6R2和ICHQ10)以及國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)制定的標(biāo)準(zhǔn)。遺憾的是,這些機(jī)構(gòu)專門為細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)商提供的VQ計(jì)劃細(xì)節(jié)極少,作為監(jiān)測(cè)、識(shí)別和降低供應(yīng)商相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)的第—步,這些生產(chǎn)商必須建立—個(gè)穩(wěn)健的VQ計(jì)劃。一個(gè)典型的VQ過(guò)程可以分為4個(gè)步驟:1.定義供應(yīng)商要求并制定供應(yīng)商問(wèn)卷2.編制—份潛在供應(yīng)商的名單,并評(píng)估能力,以確定最佳人3.進(jìn)行全面審計(jì)審計(jì)并選擇合適的供應(yīng)商4.制定并實(shí)施供應(yīng)商資格再認(rèn)定計(jì)劃定義供應(yīng)商要求供應(yīng)商評(píng)估的第—步是定義供應(yīng)商要求和設(shè)計(jì)綜合問(wèn)卷。供應(yīng)商要求應(yīng)涉及幾個(gè)不同的屬性(見(jiàn)表1的—些主題)。問(wèn)卷還應(yīng)該涉及其他重要的供應(yīng)商政策,如變更控制管理 (例如,內(nèi)部供應(yīng)商和生產(chǎn)地點(diǎn)的變更;變更通知政策的時(shí)間和例外情況)。最后,供應(yīng)商對(duì)問(wèn)題的回答應(yīng)有助于為幾個(gè)關(guān)鍵領(lǐng)域配送風(fēng)險(xiǎn)等級(jí),包括供應(yīng)商的工藝性能和質(zhì)量管理體系、糾正和預(yù)防措施(CAPA)系統(tǒng)以及變更管理系統(tǒng) (CMS)。(見(jiàn)下文,匯編—份潛在供應(yīng)商的名單并評(píng)估其能力)。表1.供應(yīng)商選擇調(diào)查問(wèn)卷中涉及的常見(jiàn)話題。?供應(yīng)商提供材料和服務(wù)的能力?供應(yīng)商對(duì)溝通內(nèi)容坦誠(chéng)、及時(shí)和透明,并有明確的計(jì)劃來(lái)管理緊急事件?供應(yīng)商對(duì)其政策和程序的控制,以確保性能穩(wěn)定?供應(yīng)商對(duì)保持質(zhì)量和性能的承諾?供應(yīng)商以文件形式提供保證,證明其能夠及時(shí)交付—致的產(chǎn)品和服務(wù)?供應(yīng)商的可持續(xù)發(fā)展政策?與要求的產(chǎn)品和服務(wù)相關(guān)的成本?及時(shí)交付所需產(chǎn)品的能力?制定政策和策略以預(yù)測(cè)和緩解與內(nèi)部供應(yīng)鏈、倉(cāng)庫(kù)、原材料和人力相關(guān)的變化?財(cái)務(wù)狀況(現(xiàn)金儲(chǔ)備)和資源,以滿足任何未來(lái)增加的商業(yè)生產(chǎn)需求?供應(yīng)商和客戶企業(yè)文化及核心價(jià)值觀的—致性編制一份潛在供應(yīng)商的名單并評(píng)估其能力接下來(lái)的步驟包括制定—份相關(guān)原材料供應(yīng)商的名單,并根據(jù)他們對(duì)問(wèn)卷的回答確定每個(gè)供應(yīng)商的能力和其他屬性。在潛在供應(yīng)商填寫問(wèn)卷的同時(shí),內(nèi)部團(tuán)隊(duì)進(jìn)行進(jìn)—步的內(nèi)部評(píng)估,重點(diǎn)關(guān)注文獻(xiàn)綜述、供應(yīng)商的技術(shù)能力、供應(yīng)商的監(jiān)管歷史(如FDA483文件、召回、警告等)、供應(yīng)商的年度報(bào)告以及任何以前或現(xiàn)在的客戶參考資料。在收到完成的供應(yīng)商問(wèn)卷后,生產(chǎn)實(shí)體的質(zhì)量保證(QA)團(tuán)隊(duì)會(huì)在收到后的指定時(shí)間段內(nèi)審查問(wèn)卷的完整性和可接受性?！┩ㄟ^(guò)內(nèi)部研究或調(diào)查問(wèn)卷發(fā)現(xiàn)有任何問(wèn)題,均會(huì)要求供應(yīng)商的QA團(tuán)隊(duì)給出書面回應(yīng),回應(yīng)中應(yīng)作出所需的具體闡釋,以便作出最終選擇。待所有問(wèn)題都得到滿意答復(fù)后,初步評(píng)估過(guò)程就完成了,與此同時(shí)縮小了供應(yīng)商名單。評(píng)估還強(qiáng)調(diào)了需要在審計(jì)階段進(jìn)行仔細(xì)審查的具體項(xiàng)目。這項(xiàng)工作的—個(gè)重要步驟包括對(duì)供應(yīng)商自身的供應(yīng)鏈戰(zhàn)略進(jìn)行評(píng)估。包括了解供應(yīng)商原材料的質(zhì)量和來(lái)源,業(yè)務(wù)連續(xù)性,以及不間斷供應(yīng)的應(yīng)急計(jì)劃。細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)商面臨的—個(gè)最糟糕情況是在臨床試驗(yàn)期間需要更換或替換原材料。同樣,—旦產(chǎn)品進(jìn)入商業(yè)化,生產(chǎn)商需要密切監(jiān)測(cè)原材料供應(yīng),以避免生產(chǎn)延誤。生產(chǎn)特定細(xì)胞治療產(chǎn)品的供應(yīng)鏈可能相當(dāng)復(fù)雜,需要監(jiān)督大量供應(yīng)商?；陲L(fēng)險(xiǎn)的監(jiān)督方法可以簡(jiǎn)化這—任務(wù)?；陲L(fēng)險(xiǎn)的策略將評(píng)估單個(gè)原材料對(duì)生產(chǎn)過(guò)程的關(guān)鍵性,從而形成—個(gè)框架,使生產(chǎn)商能夠?yàn)楣?yīng)商的能力配送風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)。這種方法也使生產(chǎn)商能夠更好地配送時(shí)間和資源來(lái)監(jiān)控商業(yè)化后的材料。表2提供了—些—般風(fēng)險(xiǎn)因素的示例,個(gè)別生產(chǎn)商可能會(huì)有額外的問(wèn)題要添加到每個(gè)級(jí)別中。表2.風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)(改編自參考文獻(xiàn)1)。風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)相關(guān)因素高?沒(méi)有替代品或很難鑒定替代品的定制產(chǎn)品?用于關(guān)鍵步驟的產(chǎn)品(例如,直接和/或患者接觸)?許可證中指定的來(lái)源,其中替代品需要進(jìn)行額外的測(cè)試(如穩(wěn)定性測(cè)試)。中?有替代產(chǎn)品?工藝上游使用的產(chǎn)品;—般用途;在經(jīng)確認(rèn)步驟中使用的產(chǎn)品?有替代產(chǎn)品,需要機(jī)構(gòu)預(yù)先批準(zhǔn)或只需進(jìn)行適度的額外測(cè)試低?有多種合格的替代產(chǎn)品;可能有安全庫(kù)存?產(chǎn)品用于行業(yè)中常見(jiàn)的經(jīng)確認(rèn)步驟中?有具有輕微監(jiān)管問(wèn)題的替代產(chǎn)品,只需通知或進(jìn)行最低限度的額外測(cè)試進(jìn)行審計(jì)并選擇最終供應(yīng)商這組縮小了范圍的供應(yīng)商將進(jìn)入到下—個(gè)評(píng)估步驟。此過(guò)程稱為審計(jì),最好由跨職能團(tuán)隊(duì)執(zhí)行,該團(tuán)隊(duì)包括來(lái)自QA、工藝開發(fā)、生產(chǎn)和分析開發(fā)部門的成員以及其他技術(shù)專家。生產(chǎn)實(shí)體的最佳做法是制定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP),以評(píng)估供應(yīng)商在不同審計(jì)級(jí)別下的能力和屬性。進(jìn)行的審計(jì)類型基于許多標(biāo)準(zhǔn),包括過(guò)去與供應(yīng)商的關(guān)系、批準(zhǔn)狀態(tài)的持續(xù)時(shí)間、供應(yīng)商是否提供關(guān)鍵或非關(guān)鍵產(chǎn)品或服務(wù),以及生產(chǎn)實(shí)體的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)定策略。有幾種類型的審計(jì)過(guò)程,按嚴(yán)格程度進(jìn)行分類:1.無(wú)需審計(jì)或檢查清單-影響最小的材料2.回顧性審計(jì)-根據(jù)過(guò)去的表現(xiàn)進(jìn)行資格審查3.書面審計(jì)-通過(guò)審計(jì)檢查清單進(jìn)行資格審查4.現(xiàn)場(chǎng)審計(jì)必須在特定的VQSOP中定義所需的審計(jì)類型和審計(jì)頻率。在資格再認(rèn)定計(jì)劃中定義持續(xù)審計(jì)頻率也是—種常見(jiàn)的做法 (見(jiàn)下文,制定供應(yīng)商資格再認(rèn)定計(jì)劃)。審計(jì)完成后,審計(jì)團(tuán)隊(duì)會(huì)生成—份評(píng)估,涵蓋供應(yīng)商設(shè)施及其質(zhì)量管理體系的適用性、供應(yīng)商員工和部門組織(包括員工等級(jí)和技能組合)、對(duì)供應(yīng)商文檔程序的審查(例如,相關(guān)的SOP),以及對(duì)供應(yīng)商供應(yīng)鏈的審查。某些情況下,在做出最終選擇之前,要求供應(yīng)商生產(chǎn)—批用于測(cè)試的原材料可能比較合適。評(píng)估完成后,QA團(tuán)隊(duì)與指定人員—起對(duì)供應(yīng)商做出最終選擇。當(dāng)供應(yīng)商被“批準(zhǔn)”時(shí),QA會(huì)更新批準(zhǔn)的供應(yīng)商名單,并向供應(yīng)商發(fā)出批準(zhǔn)函。如果供應(yīng)商被視為“未批準(zhǔn)”,QA團(tuán)隊(duì)將與相關(guān)部門合作,以確定需要哪些額外的信息和步驟來(lái)使該供應(yīng)商獲得資格。如果未獲批準(zhǔn)的供應(yīng)商提供了額外信息或?qū)⒓m正和預(yù)防措施(CAPA)落實(shí)到位,則可重新考慮其資格。如果此類供應(yīng)商的答復(fù)令人滿意,則該供應(yīng)商可能會(huì)被“批準(zhǔn)”。如果答復(fù)不令人滿意或供應(yīng)商不愿意做出適當(dāng)?shù)母淖?則他們將保持“未批準(zhǔn)”狀態(tài)。在某些例外情況下(例如,無(wú)法獲得額外的信息或沒(méi)有即時(shí)替代品),將制定風(fēng)險(xiǎn)評(píng)定計(jì)劃,以確定是否可以使用該供應(yīng)商,直到采取進(jìn)—步的必要措施以避免生產(chǎn)停工。然后為所有批準(zhǔn)的供應(yīng)商制定—個(gè)質(zhì)量協(xié)議。制定一個(gè)供應(yīng)商資格再認(rèn)定計(jì)劃在VQ流程和最終供應(yīng)商選擇之后,使用定義好和預(yù)先確定的時(shí)間間隔為供應(yīng)商資格再認(rèn)定制定計(jì)劃和SOP。雖然最初的VQ過(guò)程包括了對(duì)供應(yīng)商屬性和能力的詳細(xì)評(píng)估,但臨床和商業(yè)生產(chǎn)計(jì)劃的成功依賴于持續(xù)的VQ,定期舉行供應(yīng)商會(huì)議和審計(jì),以保持產(chǎn)品和服務(wù)的最高質(zhì)量。資格再認(rèn)定計(jì)劃定義了審計(jì)的類型和頻率,并與供應(yīng)商共享。資格再認(rèn)定計(jì)劃還確定了會(huì)引發(fā)額外審計(jì)的情況,如生產(chǎn)地點(diǎn)的改變、增加新工廠或倉(cāng)庫(kù)、將業(yè)務(wù)轉(zhuǎn)移到另—個(gè)國(guó)家,以及因現(xiàn)有原材料的全球短缺而改變?cè)牧?。與VQ過(guò)程相關(guān)的成本供應(yīng)商資格認(rèn)定對(duì)財(cái)務(wù)影響很大,可能會(huì)增加新商業(yè)細(xì)胞治療產(chǎn)品的成本。據(jù)估計(jì),每年用于現(xiàn)場(chǎng)和遠(yuǎn)程新供應(yīng)商資格認(rèn)定的費(fèi)用為1.30-1.50億美元[2]。表3分享了各種實(shí)體的—些典型成本。這些成本不包括定期重新認(rèn)定現(xiàn)有供應(yīng)商的成本或分發(fā)和評(píng)估信息請(qǐng)求的間接成本。表3.與VQ審計(jì)(VQA)相關(guān)的典型成本(美元)[2]。年均VQA成本每個(gè)VQA的平均成本年均VQA成本總計(jì)$13,259$270,033總計(jì)$12,432CRO$18,704$666,883小型公司$12,607$150,570中型公司$475,445大型公司$21,839$1,886,308總結(jié)FDA、ICH和ISO制定的高級(jí)監(jiān)管要求很有用,但在實(shí)施細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)的VQ計(jì)劃方面缺乏標(biāo)準(zhǔn)化和具體性。這導(dǎo)致了VQ計(jì)劃和流程的高度可變性和勞動(dòng)密集型,這可能導(dǎo)致細(xì)胞治療產(chǎn)品的延誤和成本負(fù)擔(dān)的增加。在細(xì)胞治療行業(yè)建立標(biāo)準(zhǔn)以簡(jiǎn)化VQ流程之前,目前的最佳實(shí)踐要求建立—種基于開放和及時(shí)對(duì)話的合作關(guān)系,明確界定資格認(rèn)定過(guò)程中的期望,以及管理風(fēng)險(xiǎn)和實(shí)現(xiàn)雙方成功的計(jì)劃。參考文獻(xiàn)1.Shimoni,Yetal.(2015).ARisk-BasedApproachtoSupplierandRawMaterialsManagement.BioProcIntl13(10):10–15.2.JayA.Turpen,SeniorConsultant,TheAvocaGroup03.04.20asseeninContractPharma.3.BioProcessSystemsAlliance(2019)TheRoleofSingle-UsePolymericSolutionsinEnablingCellandGeneTherapyProductionPart3:BestPracticesforSupplierSelection,Qualification,andValidationtoEnsureSupplyChainSecurityBio-ProcessSystemsAllianceCellandGeneTherapyCommittee.BioProcIntl17(6).4.ASTME3051–16:StandardGuideforSpecification,Design,Verification,andApplicationofSingle-UseSystemsinPharmaceuticalandBiopharmaceuticalManufacturing.ASTMInternational:WestConshohocken,PA,2016;doi:10.1520/E3051-16.本文件所述產(chǎn)品的預(yù)期用途各不相同。具體預(yù)期用途聲明請(qǐng)參閱使用說(shuō)明書(IFU)。第3節(jié):簡(jiǎn)介嵌合抗原受體(CAR)技術(shù)的使用極大推動(dòng)了某些類型癌癥的治療。這項(xiàng)技術(shù)利用免疫防御系統(tǒng)(如T細(xì)胞),通過(guò)攜帶CAR“有效載荷”修飾的免疫細(xì)胞,靶向治療患者的癌細(xì)胞。與許多新技術(shù)—樣,這項(xiàng)技術(shù)正在取得快速進(jìn)展,克服了早期CAR-T技術(shù)所遇到的障礙和困難。接下來(lái)的章節(jié)將討論開發(fā)和生產(chǎn)CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品方面的—些最新進(jìn)展,包括T細(xì)胞分離的方法,生產(chǎn)CAR-T細(xì)胞的工程改造步驟,以及擴(kuò)增經(jīng)過(guò)工程改造的細(xì)胞的策略,以方便后續(xù)患者治療(圖1)。本節(jié)還將介紹—些利用自然殺傷細(xì)胞(NK)作為免疫武器治療癌癥的新方法。作為討論生產(chǎn)過(guò)程的—個(gè)平臺(tái),本節(jié)簡(jiǎn)要介紹了CAR-T療法背后的生物學(xué)原嵌合抗原受體(CAR)是—種人工改造的受體,經(jīng)過(guò)細(xì)胞改造可以在T細(xì)胞和NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞上表達(dá)。對(duì)于CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品,T細(xì)胞被改造為能夠表達(dá)CAR蛋白,可以識(shí)別獨(dú)特腫瘤抗原的細(xì)胞。CAR蛋白由胞外域和胞內(nèi)域組成,胞外域由單克隆抗體衍生,而胞內(nèi)域源自于T細(xì)胞。這些組分的設(shè)計(jì)和構(gòu)建使得CAR-T療法成為最先進(jìn)的過(guò)繼細(xì)胞治療產(chǎn)品之—。CAR蛋白由三部分組成(圖2):2.跨膜結(jié)構(gòu)域—起固定作用基因T細(xì)胞白細(xì)胞單采術(shù)PBMC分離分選擴(kuò)增CAR白細(xì)胞單采術(shù)PBMC分離分選擴(kuò)增CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增細(xì)胞改造T細(xì)胞分離和活化T細(xì)胞分離和活化制劑灌裝和冷凍保存,然后進(jìn)行自體自體CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品(患者血液)同種異體CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品(健康供體的血液)CAR基因轉(zhuǎn)入T細(xì)胞a.T細(xì)胞的基因組編輯b.CAR基因轉(zhuǎn)入被編輯的T細(xì)胞輸注多名患者圖1.CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品工作流程中自體與同種異體方法的異同點(diǎn)。20胞外域(scFv)scFv或胞外域是腫瘤抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域,它指定了CAR-T靶標(biāo)。它位于T細(xì)胞膜上,是源自單克隆抗體的單鏈抗體片段。scFv由輕鏈和重鏈(VL和VH)的可變區(qū)組成,并通過(guò)短接頭與跨膜結(jié)構(gòu)域融合。與其他抗體—樣,這些單鏈抗體可以與蛋白質(zhì)、碳水化合物和糖脂結(jié)合?？缒そY(jié)構(gòu)域跨膜結(jié)構(gòu)域的功能僅僅是將CAR的scFv部分穩(wěn)定在T細(xì)胞表面?？缒そY(jié)構(gòu)域通常來(lái)自于CD8α,但也可基于CD4或CD28。胞內(nèi)域胞內(nèi)域源自CD3?鏈,是CAR的功能(或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))末端。CARscFv與腫瘤抗原結(jié)合后,CAR胞漿內(nèi)(CD3?鏈)形成—個(gè)聚集簇,該簇形成后將啟動(dòng)激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。CAR的各個(gè)部分的設(shè)計(jì)對(duì)于抗腫瘤反應(yīng)的成功是至關(guān)重要的。正如預(yù)期的那樣,已經(jīng)有—些改進(jìn)可以使CAR-T細(xì)胞殺傷效率更高、在體內(nèi)持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)而且毒性更小。例如,第二代CAR在胞內(nèi)域添加了免疫調(diào)節(jié)模塊(例如CD28或CD137[4-1BB])并改進(jìn)了殺傷機(jī)制。當(dāng)同時(shí)加入免疫調(diào)節(jié)模塊CD28和CD137時(shí)(第三代CAR),持續(xù)性有所提高。Tcell圖2.嵌合抗原受體的組成結(jié)構(gòu)?？缒そY(jié)構(gòu)域(錨)胞內(nèi)域(共刺激域和信號(hào)傳導(dǎo))自體與同種異體CAR-T療法早期的CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品依賴于從癌癥患者身上分離T細(xì)胞。然后對(duì)患者的T細(xì)胞進(jìn)行修飾以靶向癌細(xì)胞并重新回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。這個(gè)過(guò)程稱為自體CAR-T療法,通常需要3-4周去生產(chǎn),失敗率大約為7-10%。雖然這種方法取得了巨大的成功,但自體CAR-T療法的生產(chǎn)是—個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程,延長(zhǎng)了治療時(shí)間,而且無(wú)法擴(kuò)展。自體CAR-T療法的局限性可以通過(guò)細(xì)胞改造來(lái)自健康供體的第三方T細(xì)胞來(lái)克服。這些所謂的“現(xiàn)貨”或同種異體CAR-T細(xì)胞可以提前生產(chǎn),并能夠在患者需要時(shí)立即使用。與直接治療—名患者的自體療法不同,同種異體療法可以治療多名患者。表1總結(jié)了使用同種異體方法與自體方法相比的諸多好處。此外,同種異體方法提供了由供體來(lái)源生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)藥品,顯示出富含干細(xì)胞記憶樣T細(xì)胞(TSCM)的最佳免疫學(xué)特征。這能使同種異體CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品成為B細(xì)胞惡性腫瘤的—線療法。表1.自體和同種異體CAR-T療法之間的差異。自體自體CAR-T產(chǎn)品一種產(chǎn)品用于一個(gè)患者同種異體CAR-T產(chǎn)品—種產(chǎn)品用于多個(gè)患者患者供體-質(zhì)量和數(shù)量上的高度變異性(TSCM數(shù)量少)來(lái)自TSCM數(shù)量多的選定健康供體,在數(shù)量和質(zhì)量上表現(xiàn)出穩(wěn)定性。無(wú)法選擇所需的T細(xì)胞表型和功能可以優(yōu)化T細(xì)胞表型和功能(例如,編輯歸巢和生長(zhǎng)基因)為滿足個(gè)別患者的需求,產(chǎn)品生產(chǎn)時(shí)間緊迫在需要時(shí)為患者做好準(zhǔn)備可擴(kuò)展性有限易于擴(kuò)展單一癌癥靶點(diǎn)多個(gè)癌癥靶點(diǎn)(多基因編輯)增加治療成本(針對(duì)單個(gè)患者的質(zhì)量測(cè)試和監(jiān)管成本)減少治療成本(質(zhì)量測(cè)試和監(jiān)管成本分?jǐn)偟蕉鄠€(gè)患者身上)22同種異體CAR-T療法的問(wèn)題:克服患者的排斥反應(yīng)雖然異體CAR-T療法有助于解決自體方法所遇到的—些問(wèn)題,但它仍然面臨著諸多嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。最重要的是,異體CAR-T療法可能會(huì)因患者排斥(患者自身的免疫系統(tǒng)將供體細(xì)胞識(shí)別為外來(lái)細(xì)胞)導(dǎo)致危及生命的嚴(yán)重反應(yīng)[6,7]。圖3說(shuō)明了患者排斥同種異體T細(xì)胞背后的基本生物學(xué)原理。這種排斥是由人類白細(xì)胞抗原(HLA)I類和T細(xì)胞受體(TCR)的相互作用驅(qū)動(dòng)的,這些受體在供體和患者的T細(xì)胞上都有表達(dá),可能導(dǎo)致三種排斥情況:?移植物抗宿主病(GvHD)?宿主抗移植物病(HvGD)TCR是—種由α和β鏈組成的膜結(jié)合蛋白,作為CD3復(fù)合體分子的—部分表達(dá)在所有T細(xì)胞的表面(圖3)。表面顯示的HLAI類分子普遍存在于全身細(xì)胞上,由α鏈組成,由β2-微球蛋白(β2M,圖3)穩(wěn)定?！獋€(gè)HLAI類分子由—組6個(gè)基因組成,分別命名為因A、B和C具有高度多態(tài)性,每個(gè)基因中都有超過(guò)6,000個(gè)等位基因。非多態(tài)性的基因是E、F和G,其等位基因變體少于300個(gè)。?患者的NK細(xì)胞攻擊帶有掩蔽HLA(—種用于避免前兩種情況的修飾策略)的異體CAR+T細(xì)胞α3α2α1ααββα3α2α1ααββ受體T細(xì)胞(宿主)HLAITCRα3α2α1ααββα3α2α1ααββ受體T細(xì)胞(宿主)HLAITCRβ2M供體T細(xì)胞(移植物)TCRHLAI?3.HLAI?TCR????????????ǎ供體和患者T細(xì)胞上的TCR和HLAI之間的相互作用驅(qū)動(dòng)了兩種排斥途徑。在移植物抗宿主病中,供體TCR識(shí)別宿主T細(xì)胞的異體肽/HLAI,導(dǎo)致宿主細(xì)胞的排斥(如殺傷)。在宿主抗移植物病中,情況正好相反-宿主TCR將供體HLAI識(shí)別為外來(lái)物并將其作為目標(biāo)殺死。排斥機(jī)制是由T細(xì)胞的TCRαβ鏈與HLAI類分子的識(shí)別和相互作用引發(fā)的(圖4)。在移植物抗宿主病中,當(dāng)供體T細(xì)胞上的TCR將受體細(xì)胞(組織)上的HLAI類復(fù)合物視為外來(lái)物并對(duì)其進(jìn)行攻擊時(shí),就會(huì)出現(xiàn)同種異體排斥反應(yīng)[8]。同樣,在宿主抗移植物病中,受體T細(xì)胞的TCR將供體T細(xì)胞上的HLAI類復(fù)合物識(shí)別為外源物并對(duì)其進(jìn)行攻擊。為了消除這些排斥障礙,科學(xué)家可以利用TCR和HLAI類復(fù)合物的基本生物學(xué)特性。更具體地說(shuō),通過(guò)基因編輯破壞β2M可用于阻止成熟的供體HLAI類分子到達(dá)細(xì)胞表面,從根本上保護(hù)供體T細(xì)胞免受受體T細(xì)胞識(shí)別和消除。同樣,通過(guò)基因編輯破壞供體細(xì)胞TCRα或β鏈可以防止受體T細(xì)胞識(shí)別和攻擊供體T細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞受體T細(xì)胞受體T細(xì)胞(宿主)腫瘤抗原llCAR-ScFv受體T細(xì)胞(宿主)Xααα2α3α1β2MXα2α3α1β2MHLAITCRαXαββ同種異體Xααα2α3α1β2MXα2α3α1β2MHLAITCRαXαββ同種異體CAR-T細(xì)胞(供體細(xì)胞.移植物)宿主對(duì)抗移植物移植物對(duì)抗移植物圖4.防止同種異體排斥反應(yīng)的現(xiàn)貨型策略。右側(cè):消除移植的異體CAR-T細(xì)胞上的TCRα鏈可以防止移植物抗宿主病(GvHD)。左側(cè):通過(guò)破壞移植的異體CAR-T細(xì)胞上的β2M來(lái)消除HLAI,可以防止宿主抗移植物病(HvGD)。23然而,這些方法會(huì)導(dǎo)致第三個(gè)排斥障礙,其原因是供體細(xì)胞上HLAI類的消失,使供體細(xì)胞容易受到受體自身NK細(xì)胞的靶向(圖5),也被稱為“缺失自我信號(hào)”。為了克服受體NK細(xì)胞介導(dǎo)的HLA或TCR供體細(xì)胞消除,研究人員可以對(duì)供體細(xì)胞進(jìn)行基因修飾,使其表達(dá)—種抑制性分子,如非多態(tài)HLA-E(圖5)。這種修飾可以通過(guò)將序列插入或“敲入”HLA-E的序列與β2M融合。這樣做能夠在供體細(xì)胞上穩(wěn)定表達(dá)—種HLAI類分子,并阻止對(duì)這些細(xì)胞產(chǎn)生受體NK介導(dǎo)的殺傷(圖5)。腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞同種異體CAR-T細(xì)胞(供體細(xì)胞移植物)抑制性受體抑制性受體HLA-Eα1NKG2A同種異體CAR-T細(xì)胞(供體細(xì)胞移植物)抑制性受體抑制性受體HLA-Eα1NKG2ACD94α3β2Mα2 NKG2A CD94kiII同種異體CAR-T細(xì)胞(供體細(xì)胞移植物)激活配體激活受體激活配體激活受體NK細(xì)胞(宿主)缺失HLAI表達(dá)促使NK細(xì)胞殺傷同種異體CAR-T細(xì)胞活化NK細(xì)胞敲入HLA-E(非經(jīng)典的HLAI)圖5.在供體T細(xì)胞上添加HLA-E將阻止宿主NK的殺傷。缺乏HLAI蛋白的同種異體CAR-T細(xì)胞將成為NK細(xì)胞的目標(biāo)(也被稱為“缺失自我信號(hào)”)。這是—種對(duì)不表達(dá)HLAI的細(xì)胞的正常免疫反應(yīng)。帶有敲入HLA-E基因的經(jīng)過(guò)工程改造細(xì)胞將防止宿主NK細(xì)胞殺傷同種異體CAR-T細(xì)胞。25總結(jié)同種異體T細(xì)胞來(lái)源的選擇能使所用材料具有更高質(zhì)量起始血液(來(lái)自健康第三方供體)、改善免疫細(xì)胞組成,從而提高最終產(chǎn)品的可擴(kuò)展性。與自體方法不同,同種異體方法可治療多個(gè)患者。使用同種異體T細(xì)胞來(lái)源可導(dǎo)致患者排斥(如GvHD和HvGD),正在利用技術(shù)進(jìn)步來(lái)緩解其中的—些問(wèn)題,例如通過(guò)使用HLAI類或TCR等基因的基因編輯來(lái)克服在宿主系統(tǒng)中識(shí)別“異物”。臨床上的成功表明,采用其中—些掩蔽技術(shù)的同種異體CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品能夠?qū)⑦@種方法用于更多的患者,并且隨著多家專注于同種異體CAR的公司已經(jīng)在臨床測(cè)試同種異體CAR-T療法,正在加速這—領(lǐng)域的發(fā)展(表2)。表2.具有臨床試驗(yàn)的同種異體CAR-T公司。公司產(chǎn)品CAR靶標(biāo)同種異體細(xì)胞來(lái)源T細(xì)胞AllogeneandP?zerKuurTherapeuticsKUR-502NK細(xì)胞和T細(xì)胞CellectisandP?zerT細(xì)胞CelyadBCMAT細(xì)胞CRISPRTherapeuticsT細(xì)胞FateTherapeuticsiPSC衍生的T細(xì)胞PoseidaTherapeuticsP-BCMA-ALL01、P-MUC1-ALLO1T細(xì)胞PrecisionBiosciencesPBCAR269AT細(xì)胞TessaTherapeuticsCD30.CAR-EBVSTCD30參考文獻(xiàn)1.IrvingM,etal.(2017)EngineeringChimericAntigenReceptorT-CellsforRacinginSolidTumors:Don,tForgettheFuel.FrontImmunol8:267.2.FujiwaraK,etal.(2020)HingeandTransmembraneDomainsofChimericAntigenReceptorRegulateReceptorExpressionandSignalingThreshold.Cells9(5):1182.3.JuneC,etal.(2020)CARTcellimmunotherapyforhumancancer.Science359(6382):1361–1365.4.SkorkaK,etal.(2020)TheApplicationofCAR-TCellsinHaematologicalMalignancies.ArchImmunolTherExp(Warsz)68(6):34.5./.6.DepilS,etal.(2020)“Off-the-shelf”allogeneicCARTcells:developmentandchallenges.NatRevDrugDiscov19:185–199.7.W.Qasim(2019)AllogeneicCARTcelltherapiesforleukemia.AmJHematol94:S50–S54.8.E.Ingulli(2010)Mechanismofcellularrejectionintransplantation.PediatrNephrol25:61–74,2010.9.EMBLImmunoPolymorphismDatabase.10.LjunggrenHandK?rreK.(1990)Insearchof‘missingself,:MHCmoleculesandNKcellrecognition.ImmunolToday11(7):237–244.11.SunJandLanierL(2008)Cuttingedge:viralinfectionbreaksNKcelltoleranceto“missingself”.JImmunol1812.PallmerKandOxeniusA(2016)RecognitionandregulationofTcellsbyNKcells.FrontImmunol7:251.13.GornalusseGG,etal.(2017)HLA-E-expressingpluripotentstemcellsescapeallogeneicresponsesandlysisbyNKcells.NatBiotechnol35:765–772.這些文件所述產(chǎn)品的預(yù)期用途各不相同。具體預(yù)期用途聲明請(qǐng)參閱使用說(shuō)明書(IFU)。第4節(jié):簡(jiǎn)介在任意—款細(xì)胞治療產(chǎn)品開發(fā)和生產(chǎn)工作流程的基礎(chǔ)上,起始細(xì)胞材料的質(zhì)量直接影響最終產(chǎn)品的活率和患者治療的功效。大多數(shù)細(xì)胞分離方法,特別是外周血單核細(xì)胞 (PBMC)的分離,目前是使用開放式系統(tǒng)進(jìn)行的,這可能導(dǎo)致差錯(cuò)和污染,進(jìn)而導(dǎo)致無(wú)法產(chǎn)出可行的細(xì)胞治療產(chǎn)品。此外,在生產(chǎn)過(guò)程的擴(kuò)增階段,供體產(chǎn)品的變異性會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞組成、細(xì)胞活率和敏感性的差異。由于多種原因,并非所有患者(包括健康供體)都能以適合該過(guò)程的理想數(shù)量有效地動(dòng)員功能性T細(xì)胞。因此,T細(xì)胞分離工作流程必須靈活,以便能夠進(jìn)行各種調(diào)整,同時(shí)無(wú)論從患者或供體那里獲得何種輸入材料,仍能產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)化的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品。理想的細(xì)胞分離工作流程應(yīng)是自動(dòng)化的、封閉的且—致的。本節(jié)將討論P(yáng)BMC的分離以及要工程改造的T細(xì)胞群 (CD3+)的分離和激活。本節(jié)還將討論使用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSC)衍生的細(xì)胞和NK細(xì)胞的替代細(xì)胞方法,這是克服更傳統(tǒng)方法問(wèn)題的潛在解決方案。健康供體特征同種異體細(xì)胞治療產(chǎn)品的開發(fā)始于從捐獻(xiàn)的血液中分離出T細(xì)胞的過(guò)程,這—過(guò)程被稱為白細(xì)胞單采術(shù)。要進(jìn)入臨床試驗(yàn),需要有足夠數(shù)量的捐獻(xiàn)血液,并具有正確的細(xì)胞組分和表型。對(duì)于同種異體療法,理想的供體血液最好來(lái)自年輕個(gè)體。捐獻(xiàn)的血液成分中,單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞(特別是粒細(xì)胞)的比例應(yīng)該很低,并且細(xì)胞應(yīng)具有有效的倍增時(shí)間。供體血液應(yīng)具有免疫學(xué)特征,包括正常的CD3+細(xì)胞數(shù)量,平衡的CD4/CD8比率,足夠數(shù)量的干細(xì)胞樣記憶細(xì)胞,以及CD62L+CCR7+T細(xì)胞的表達(dá)。正如預(yù)期的那樣,細(xì)胞治療產(chǎn)品開發(fā)商和生產(chǎn)商希望T細(xì)胞群的純度盡可能高,有時(shí)還會(huì)尋找特定的T細(xì)胞亞群。劣質(zhì)起始材料可能導(dǎo)致無(wú)法將其用于細(xì)胞治療產(chǎn)品處理,并最終導(dǎo)致供體產(chǎn)品無(wú)法進(jìn)入臨床。然而,具有高產(chǎn)量和高純度的高效細(xì)胞分離方法是可靠的,可以減輕在供體血液質(zhì)量方面的壓力。262627PBMC??—旦獲得并對(duì)捐獻(xiàn)血液進(jìn)行了特性鑒定,下—步就是分離PBMC。通常情況下,分離方法開放或封閉的特點(diǎn)取決于所需的直接用戶交互量。封閉式方法是首選方法,這樣做能降低污染和用戶錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn),而且對(duì)于—些臨床應(yīng)用來(lái)說(shuō),可能需要這樣做。最著名的分離PBMC的做法是使用Ficoll培養(yǎng)基的密度梯度離心法。雖然這種方法能夠成功地將PBMC從紅細(xì)胞中分離出來(lái),但分離出的PBMC會(huì)保留污染物,如粒細(xì)胞、單核細(xì)胞,甚至—些殘留的紅細(xì)胞。大多數(shù)密度梯度離心分離是使用開放式系統(tǒng)進(jìn)行的,這使得該過(guò)程容易出現(xiàn)錯(cuò)誤、污染和人與人的差異性。雖然存在自動(dòng)化的封閉式密度梯度離心系統(tǒng),但這些系統(tǒng)往往會(huì)丟失細(xì)胞,因缺乏系統(tǒng)靈活性而降低產(chǎn)量,而且價(jià)格也會(huì)大大增加。AACC最近的—種封閉系統(tǒng)方法依賴于逆流離心,它根據(jù)細(xì)胞的大小和密度來(lái)分離細(xì)胞。使用這種技術(shù)的系統(tǒng)(如GibcoCTSRotea系統(tǒng))通過(guò)在流化床中施加—個(gè)與離心力相反的恒定流動(dòng)力來(lái)懸浮細(xì)胞(圖1)。懸浮的細(xì)胞被輕輕濃縮而不形成沉淀,然后以非常高的回收率進(jìn)行洗滌。使用淘析,可以去除死細(xì)胞以優(yōu)化細(xì)胞群的活率。調(diào)整離心速度和流速可以使細(xì)胞根據(jù)大小和密度進(jìn)行分開,而剪切力最BBDD?1.????CFC???ǎ封閉系統(tǒng)CTSRotea儀器依靠逆流技術(shù),根據(jù)大小和密度分離細(xì)胞。?A?細(xì)胞上樣:使用“平衡的”g力和逆流參數(shù),將由培養(yǎng)基和細(xì)胞組成的起始物料通過(guò)中心管引入CFC腔室。?B?淘析:較大或密度較大的細(xì)胞會(huì)在流化床中被捕獲,而較小或密度較低的細(xì)胞和碎片則會(huì)通過(guò)流化床并在CFC腔室頂部被“洗脫”。?C?培養(yǎng)基交換和洗滌:將洗滌緩沖液泵送至流化床,替代起始產(chǎn)品中的原始培養(yǎng)基。注:流化床可實(shí)現(xiàn)十分快速高效的洗滌。?D?細(xì)胞濃縮:洗滌和濃縮的細(xì)胞現(xiàn)可從CFC腔室中回收,只需簡(jiǎn)單地反轉(zhuǎn)泵并通過(guò)內(nèi)部管路提取濃縮物。關(guān)于逆流離心技術(shù)的更多細(xì)節(jié)和視頻可以在這里找到。28密度梯度離心和逆流離心產(chǎn)生的結(jié)果相當(dāng)(圖2)。然而,逆流離心的明顯優(yōu)勢(shì)在于其執(zhí)行時(shí)間更短;而且最重要的是,其可以在更理想的封閉系統(tǒng)設(shè)置中執(zhí)行。表1總結(jié)了PBMC分離方法。A密度梯度離心分離(2小時(shí))CD45FITCCD45FITC單核細(xì)胞和T細(xì)胞B細(xì)胞和T細(xì)胞CD56PerCP–eFluorCD56PerCP–eFluor710 CD14APCCD19PE CD3eFluor450 CD3 CD3eFluor450 CD3eFluor450其他細(xì)胞(血小板)其他細(xì)胞(血小板)46%54%54%96%白細(xì)胞80%T細(xì)胞8%B細(xì)胞9%單核細(xì)胞80%T細(xì)胞8%B細(xì)胞B逆流離心分離(<30分鐘)CD45CD45FITCB細(xì)胞和T細(xì)胞NK細(xì)CD56PerCPCD56PerCP–eFluor710 CD14APCCD19PE CD3 CD3eFluor450 CD3eFluor450CD3eFluor450其他細(xì)胞(血小板)其他細(xì)胞(血小板)66%34%34%97%白細(xì)胞80%8%9%單核細(xì)胞3%NK80%8%圖2.使用封閉式逆流離心系統(tǒng)和開放式密度梯度系統(tǒng)從紅細(xì)胞中分離PBMC。將單—供體白細(xì)胞單采樣本的液體分為兩份,并(A)使用Ficoll聚合物通過(guò)密度梯度離心或(B)使用CTSRotea系統(tǒng)通過(guò)逆流離心分離PBMC。CTSRotea系統(tǒng)可在30分鐘內(nèi)從白細(xì)胞單采樣本中分離出PBMC,且分離性能幾乎與密度梯度系統(tǒng)相當(dāng),并具有封閉式處理的附加優(yōu)點(diǎn)。表1.PBMC分離方法的比較。優(yōu)點(diǎn)密度梯度離心廣受認(rèn)可逆流離心縮短處理時(shí)間廣泛應(yīng)用方案靈活性平價(jià)(僅限開放式系統(tǒng))減少用戶錯(cuò)誤和差異性減少污染可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化缺點(diǎn)過(guò)程冗長(zhǎng)昂貴(封閉式系統(tǒng))昂貴(封閉式系統(tǒng))本文件所述產(chǎn)品的預(yù)期用途各不相同。具體預(yù)期用途聲明請(qǐng)參閱使用說(shuō)明書(IFU)。T細(xì)胞分離和激活PBMC分離后的下—步是T細(xì)胞分離,以去除其他細(xì)胞類型的任何殘留污染,并提高產(chǎn)物特異性。然后再進(jìn)行激活。同種異體供體血液的固有可變性導(dǎo)致無(wú)法區(qū)分細(xì)胞類型。為了克服這個(gè)問(wèn)題,已經(jīng)開發(fā)出基于磁珠的T細(xì)胞群篩選方法。這些方法使用與抗體結(jié)合的磁珠,而抗體可識(shí)別T細(xì)胞表面標(biāo)志物并與之結(jié)合。當(dāng)放置在磁體附近時(shí),磁珠-T細(xì)胞復(fù)合物結(jié)合并被保留,而不需要的細(xì)胞類型則會(huì)被沖走?！┓蛛x,T細(xì)胞便可以從磁珠中釋放出來(lái)(見(jiàn)圖3)。目前市面上有多種磁珠產(chǎn)品。其中—些平臺(tái)可用于極具特異性的細(xì)胞群(例如CD4/CD8+或CD62L+),這些細(xì)胞群后續(xù)可通過(guò)其他方式激活。另—種GibcoCTSDynabeadsCD3/CD28系統(tǒng)可提供T細(xì)胞激活和擴(kuò)增所需的原始和共刺激信號(hào),無(wú)需單獨(dú)的激活步驟,從而減少引入污染的可能加入磁珠;置于振蕩平臺(tái)上30分鐘置于磁體上;去除上清液和非特異性細(xì)胞加入新鮮培養(yǎng)基和細(xì)胞因子進(jìn)行擴(kuò)增圖3.使用CTSDynabeadsCD3/CD28分離和激活T細(xì)胞以進(jìn)行后續(xù)工程改造。收集PBMC,并在細(xì)胞培養(yǎng)袋中使用CTSDynabeadsCD3/CD28(磁珠與細(xì)胞比為3:1)激活。將培養(yǎng)基中的細(xì)胞和磁珠置于振蕩平臺(tái)上孵育30分鐘。30分鐘后,將培養(yǎng)袋置于Gibco?CTS?DynaMag?磁力架上,并收集附著在磁珠上的CD3/CD28+細(xì)胞。丟棄上清液和非特異性細(xì)胞。加入含有細(xì)胞因子的新鮮培養(yǎng)基,以便同時(shí)進(jìn)行T細(xì)胞激活和擴(kuò)增。用該方法分離出的CD3+CD28+T細(xì)胞回收率超過(guò)90%,受到均勻刺激(>95%的CD25+細(xì)胞),CD3+T細(xì)胞純度超過(guò)95%,整個(gè)過(guò)程無(wú)需抗原呈遞細(xì)胞(APC)。用有關(guān)此過(guò)程的更多詳細(xì)信息,請(qǐng)參閱使用CTSDynabeadsCD3/CD28一步分離和激活初始和早期記憶T細(xì)胞。29iPSC衍生的CARNK細(xì)胞同種異體工作流程的—個(gè)主要問(wèn)題是細(xì)胞數(shù)量或起始材料不足以創(chuàng)建用于患者輸注的產(chǎn)品。為了克服這—限制,已經(jīng)開發(fā)出—種用于從iPSC中獲得NK細(xì)胞或T細(xì)胞的革命性方法。NK細(xì)胞的使用減少了排斥障礙(例如,人移植物抗宿主病),并且NK細(xì)胞可從多種不同來(lái)源產(chǎn)生,例如臍帶血、骨髓、人類胚胎干細(xì)胞和iPSC。NK細(xì)胞的—個(gè)顯著優(yōu)勢(shì)是,與T細(xì)胞不同,在殺死多個(gè)靶細(xì)胞后,NK細(xì)胞的存活率有所提高。此外,NK細(xì)胞可產(chǎn)生與T細(xì)胞不同的細(xì)胞因子譜。T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS),已觀察到—些使用過(guò)繼細(xì)胞治療產(chǎn)品的患者中出現(xiàn)這種危及生命的疾病,而使用NK細(xì)胞有可能避免這種情況。同種異體療法排斥反應(yīng)最常見(jiàn)的原因是由于iPSC衍生產(chǎn)物的HLAI類基因存在差異,導(dǎo)致供體和受體之間的不匹配。T細(xì)胞定期與HLA復(fù)合物相互作用,因此表面HLA復(fù)合物的任何變化都表明該物質(zhì)是外來(lái)物質(zhì)。相反,NK細(xì)胞可以以HLA非依賴的方式對(duì)不同的腫瘤靶標(biāo)表現(xiàn)出細(xì)胞毒性,這可以減輕供體和受體之間的不匹配問(wèn)題。原代NK細(xì)胞的分離困難且復(fù)雜,并且可能導(dǎo)致產(chǎn)量低下,使得iPSC衍生的CARNK細(xì)胞成為同種異體工作流程中更具吸引力的選擇。為此,主要目標(biāo)是確定iPSC細(xì)胞系,以避免同種異體排斥反應(yīng),并加快將細(xì)胞治療產(chǎn)品推廣到臨床?？偨Y(jié)同種異體CAR-T細(xì)胞的制備需要鑒定健康的第三方供體,并分離足夠數(shù)量的T細(xì)胞,以用于后續(xù)的工程改造步驟。理想情況下應(yīng)在封閉的系統(tǒng)環(huán)境中進(jìn)行分離,該環(huán)境可提供修飾靈活性,以便輕松解釋來(lái)源材料的差異。最新進(jìn)展調(diào)查了其他來(lái)源或細(xì)胞類型(即iPSC衍生的NK細(xì)胞)的使用,以進(jìn)—步擴(kuò)展和改進(jìn)CAR技術(shù)的應(yīng)用。其他資源?GrievinkHW,etal.(2016)ComparisonofThreeIsolationTechniquesforHumanPeripheralBloodMononuclearCells:CellRecoveryandViability,PopulationComposition,andCellFunctionality.BiopreservBiobank14(5):410–415.?One-stepisolationandactivationofnaiveandearlymemoryTcellswithCTSDynabeadsCD3/CD28.?HabibS,TariqSM,TariqM.(2019)ChimericAntigenReceptor-NaturalKillerCells:TheFutureofCancerImmunotherapy.OchsnerJ19(3):186–187.?GornalusseGG,etal.(2017)HLA-E-expressingpluripotentstemcellsescapeallogeneicresponsesandlysisbyNKcells.NatBiotechnol35(8):765–772.?huH,etal.(2020)MetabolicReprogramingviaDeletionofCISHinHumaniPSC-DerivedNKCellsPromotesInVivoPersistenceandEnhancesAnti-tumorActivity.CellStemCell27(2):224–237.?WuY,etal.(2017)DevelopmentalandFunctionalControlofNaturalKillerCellsbyCytokines,–Frontierinimmunology.FrontImmunol8:930.參考文獻(xiàn)1.TanYSandLeiYL.(2019)Isolationoftumor-infiltratinglymphocyteson.MethodsMolBiol3030byon.MethodsMolBiol30303030第5節(jié):簡(jiǎn)介同種異體CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品開發(fā)的下—步是對(duì)分離后的T細(xì)胞的基因組成進(jìn)行工程改造或改變。這些改變最終產(chǎn)生的T細(xì)胞可避免危及生命的排斥反應(yīng)問(wèn)題(更多背景信息,請(qǐng)參閱第3節(jié),細(xì)胞分離、改造和擴(kuò)增概述)。此外,這些改變可引入靶向腫瘤細(xì)胞表面抗原的嵌合抗原受體(CAR)。目前已存在多種細(xì)胞改造方法,本節(jié)將介紹目前使用的三種基因編輯工具:鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN)和規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列(CRISPR)相關(guān)蛋白9(CRISPR-Cas9)。本節(jié)還將討論向T細(xì)胞遞送上述工具的幾種方法,以及工程改造工作流程的總體概述。敲入與敲除使用基因編輯工具設(shè)計(jì)來(lái)自第三方同種異體健康供體的現(xiàn)貨型或通用CAR-T細(xì)胞,是通過(guò)靶向供體細(xì)胞DNA的變化使特異性基因發(fā)生突變。這些工具以兩種方式促進(jìn)同種異體T細(xì)胞的基因編輯(圖1):1.敲入—添加目的基因以在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)預(yù)期功能(例如,添加HLA-E以防止宿主NK殺死同種異體CAR-T細(xì)胞)。2.敲除—破壞供體T細(xì)胞不需要的基因功能,通常是通過(guò)刪除基因序列(例如,消除TCR的TCRαβ鏈)?？茖W(xué)家們通常依靠DNA特異性內(nèi)切酶進(jìn)行基因敲入或敲除,該內(nèi)切酶利用“向?qū)А钡鞍谆蚝怂嵬炊ㄏ蛐迯?fù)(HDR)到達(dá)特定切割位點(diǎn)。不精確的NHEJ容易出錯(cuò),并可能導(dǎo)致靶標(biāo)位點(diǎn)發(fā)生小的插入或缺失(indel)。如果在靶向基因的編碼區(qū)精確進(jìn)行NHEJ修復(fù),將產(chǎn)生該基因的indel或敲除(圖1)。在HDR中,將兩側(cè)序列與切割位點(diǎn)周圍序列同源的供體模板序列(例如HLA-ET細(xì)胞改造)添加到反應(yīng)中,以便通過(guò)重組插入。這種所需的序列插入導(dǎo)致精確的基因添加,稱為敲入突變(圖1)。染色體和經(jīng)過(guò)工程改造的核酸酶序列特異性雙鏈斷裂利用細(xì)胞修復(fù)機(jī)制進(jìn)行DNA斷裂修復(fù)圖1.突變類型由特定的細(xì)胞修復(fù)機(jī)制決定。3132用于創(chuàng)建同種異體T細(xì)胞的基因編輯技術(shù)許多靶向基因組修飾的方法都可以產(chǎn)生這些永久性突變,但有三種基因編輯工具已經(jīng)過(guò)充分研究,用于創(chuàng)建具有敲除TCR復(fù)合體或敲入HLA-E基因的同種異體CAR-T細(xì)胞:ZFN、TALEN和規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列 (CRISPR)-CRISPR相關(guān)蛋白9(CRISPR-Cas9)(圖2)。ZFNZFN是—種可被專門設(shè)計(jì)為人工核酸內(nèi)切酶的轉(zhuǎn)錄因子,可以切割雙鏈DNA的特定序列。ZFN由兩部分組成:第—部分是由多個(gè)鋅指模塊組成的含鋅DNA結(jié)合蛋白,其通過(guò)DNA-蛋白質(zhì)相互作用作為向?qū)ЫY(jié)合至所需的DNA序列。第二部分是FokI核酸酶,其通過(guò)柔性肽接頭連接到DNA結(jié)合蛋白,并切割DNA形成雙鏈斷裂(圖2A)[5]。每個(gè)鋅指模塊與三個(gè)連續(xù)的核苷酸相互作用,因此兩個(gè)鋅指模塊將與6個(gè)連續(xù)的核苷酸相互作用,依此類推。全功能鋅指DNA結(jié)合域由3-6個(gè)單獨(dú)的鋅指模塊組成,這些模塊與9-18個(gè)堿基對(duì)的高度特異性靶結(jié)合位點(diǎn)雜交,決定DNA序列切割區(qū)域的特異性。在實(shí)踐中,ZFN以右側(cè)和左側(cè)ZFN配對(duì)使用,且每個(gè)FokI必須二聚化以作為核酸酶切割所需的雙鏈DNA區(qū)域?？蓪\指DNA結(jié)合蛋白設(shè)計(jì)為與基因組的所需部配送對(duì),將這些DNA結(jié)合蛋白和核酸酶放置在準(zhǔn)確的區(qū)域,從而產(chǎn)生所需的突變或改變。ZFN設(shè)計(jì)工作非常耗時(shí),因?yàn)镈NA結(jié)合蛋白(—種三級(jí)結(jié)構(gòu))需要與3個(gè)連續(xù)核苷酸精確“匹配”(表1)。由于存在左側(cè)和右側(cè)ZFN要求,該過(guò)程需要花費(fèi)兩倍的時(shí)間。這—嚴(yán)格要求也使ZFN成為—種具有高度特異性的工程改造工具,幾乎沒(méi)有脫靶效應(yīng)。TALENTALEN是另—種專門設(shè)計(jì)的DNA核酸酶,與ZFN類似。TALEN同樣具有—個(gè)源自Xanthamonas的DNA結(jié)合蛋白(TALE)和—個(gè)作為切割域的Fok1核酸酶。與ZFN—樣,TALEN同樣以模塊對(duì)的形式工作(即右側(cè)TALEN和左側(cè)TALEN),且兩個(gè)FokI核酸酶必須二聚化以形成可切割目標(biāo)雙鏈DNA的功能性核酸酶(圖2B)。DNA結(jié)合向?qū)ЫM分是12-20個(gè)成鏈排列的單個(gè)TALE重復(fù)序列,其中與單個(gè)DNA堿基對(duì)的結(jié)合基于每個(gè)TALE單元第12位和13位的重復(fù)可變雙殘基(RVD)[6]。TAL