B41中華人民共和國國家標準代替GB/T16551—20082020-12-14發(fā)布2020-12-14實施國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會Ⅰ前言 引言 ２規(guī)范性引用文件 ４臨床癥狀與病理變化 臨床癥狀 病理變化 結果判定 器材 試劑 樣品采集 保存與運輸 樣本處理 ６實驗室病原學診斷方法 免疫熒光抗體試驗 免疫過氧化物酶試驗 豬瘟病毒分離與鑒定 豬瘟病毒-檢測方法 豬瘟病毒實時熒光-檢測方法 ７實驗室抗體檢測方法 豬瘟病毒中和試驗 豬瘟病毒阻斷抗體檢測方法 豬瘟抗體間接檢測方法 豬瘟病毒化學發(fā)光抗體檢測方法 附錄規(guī)范性附錄）試劑配制 附錄規(guī)范性附錄）豬瘟病毒測定 附錄規(guī)范性附錄）校準品的制備 Ⅲ本標準按照—給出的規(guī)則起草。本標準代替—《豬瘟診斷技術》。與—相比，主要技術變化如下：—修改了“臨床及病理學診斷”部分，并更名為“臨床癥狀與病理變化”（見第４章年版的—刪除了“兔體交互免疫試驗”部分（見年版的—修改了“免疫酶染色試驗”和“直接免疫熒光抗體試驗”部分，更名為“免疫熒光抗體試驗—刪除了“豬瘟病毒反轉錄聚合酶鏈式反應-”（見年版的—修改了“熒光抗體病毒中和試驗”部分，并更名為“豬瘟病毒中和試驗”（見年版的—刪除了“豬瘟單抗酶聯(lián)免疫吸附試驗”（見年版的—增加了“豬瘟病毒阻斷抗體檢測方法”“豬瘟抗體間接檢測方法”和“豬瘟病毒本標準由中華人民共和國農業(yè)農村部提出。本標準由全國動物防疫標準化技術委員會歸口。本標準起草單位：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。Ⅳ引言是由豬瘟病毒(感染豬引起的一種高度接觸性致死性傳染性疾病，可造成巨大的經濟損失和社會影響。被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須報告的疫病，我國規(guī)定CSF為一類動物疫病。豬包括野豬是本病唯一的自然宿主，發(fā)病豬和帶毒豬是本病的傳染源，不同年齡、性別、品種的豬均易感，一年四季均可發(fā)生。感染豬在發(fā)病前能通過分泌物和排泄物排毒，并持續(xù)整個病程。與感染豬直接接觸是本病傳播的主要方式，病毒也可通過精液、胚胎、豬肉和泔水等方式間接傳播，人、其他動物如鼠類和昆蟲、器具等均可成為重要傳播媒介。是黃病毒科(瘟病毒屬(的成員之一只有個血清型10個基因亞型，不同基因型間有很好的抗原交叉反應。近年來，由于臨床上出現了CSFV持續(xù)性感染所致的無典型臨床癥狀和病理變化的慢性和隱性感染形式，以及多種疫病混合感染的現象，CSF的臨床診斷和病理學診斷只能作為初步診斷的依據，對CSF病原的實驗室檢測是確定病毒感染的主要方法，要求診斷技術和標準更加特異和敏感。由于診斷的需求和診斷技術的發(fā)展，GB/T16551—2008已經不適應要求。針對CSF感染普遍存在病毒載量低、病毒血癥時間短等特點，最適用于活體動物的檢測樣本首先是扁桃體，其次為抗凝全血；若為病死動物，可采集扁桃體、脾臟、腎臟、胰臟、回腸、回盲瓣、腸系膜淋巴結和頜下淋巴結等含毒量較高的臟器進行檢測。采用CSFV抗原免疫檢測法［免疫熒光抗體試驗(免疫過氧化物酶試驗(可檢測感染組織和細胞中的病毒抗原，用于確診；如果結果可疑或者樣本不足，可以通過核酸檢測技術確認。如果樣本量大，可采用豬瘟病毒實時熒光RT-PCR檢測方法進行初篩，陽性者采用豬瘟病毒RT-nPCR檢測方法和序列測定進行確診和基因分型；上述都不能確診的樣本，采用經典的CSFV分離技術確診，分離的病毒可用于進一步研究。上述三類方法均為OIE推薦的方法。目前，實施CSF疫苗全面免疫是我國防控CSF的重要手段，CSFV抗體檢測主要用于CSF疫苗的免疫效果評價，而對于一些不實施免疫CSF疫苗的國家和地區(qū)來說，CSF抗體檢測可以作為未免疫豬瘟疫苗豬群感染CSF的診斷依據。而在我國，ELISA方法已成為監(jiān)測免疫后CSFV抗體保護水平、評價豬群免疫效果的最主要手段，根據檢測目的不同，可選擇不同的方法。對于我國CSF疫苗采取的全面免疫后而開展的大規(guī)模普查，間接ELISA抗體檢測方法能夠更加真實地反映中和抗體水平，為免疫程序制定和抗體水平監(jiān)測提供可靠的數據支持；阻斷ELISA抗體檢測方法因其特異性強，可用于引種的種豬檢測；化學發(fā)光抗體檢測方法是近年來發(fā)展起來的一種新的酶聯(lián)免疫檢測方法，利用化學發(fā)光底物提高檢測的靈敏度，同時增加檢測的線性范圍。本標準中的CSFV化學發(fā)光抗體檢測方法中采用了CSFV抗體的校準品，并在檢測中繪制校準曲線，可以使抗體檢測結果相對定量。另外，采用該方法進行檢測，能夠大大縮短檢測時間，適應于田間推廣使用。最終的抗體確認可采用“金標準”方法病毒中和方法和兩類方法均為推薦的方法也是國際貿易指定試驗。本標準中涉及了5種CSF病原和4種CSFV抗體的實驗室檢測方法，均可用于CSF病原和抗體的定性檢測。使用者可根據自身的實驗條件、能力水平以及待檢樣本的實際情況選擇合適的方法。本文件的發(fā)布機構提請注意，聲明符合本文件時，可能涉及7.2和7.3與CSFVE2蛋白表達及純化相關的專利的使用。本文件的發(fā)布機構對于該專利的真實性、有效性和范圍無任何立場。該專利持有人已向本文件的發(fā)布機構保證，他愿意同任何申請人在合理且無歧視的條款和條件下，Ⅴ就專利授權許可進行談判。該專利持有人的聲明已在本文件的發(fā)布機構備案。相關信息可以通過以下聯(lián)系方式獲得：專利持有人姓名：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。地址：北京中關村南大街8號。請注意除上述專利外，本文件的某些內容仍可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別這些專利的責任。1本標準規(guī)定了豬瘟的臨床癥狀與病理變化，樣本的采集、保存、運輸和處理，實驗室病原學診斷方法以及實驗室抗體檢測方法等。本標準適用于豬（家豬、野豬）的豬瘟診斷。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27540豬瘟病毒實時熒光RT-PCR檢測方法GB/T34729—2017豬瘟病毒阻斷ELISA抗體檢測方法GB/T35906豬瘟抗體間接ELISA檢測方法豬瘟病毒檢測方法NY/T541獸醫(yī)診斷樣本采集、保存與運輸技術規(guī)范3縮略語下列縮略語適用于本文件。豬瘟豬瘟病毒(乙二胺四乙酸(酶聯(lián)免疫吸附試驗(免疫熒光抗體試驗(異硫氰酸熒光素(辣根過氧化物酶(免疫過氧化物酶試驗(基礎培養(yǎng)基(國家臨床單位(免疫熒光中和試驗(過氧化物酶聯(lián)中和試驗(磷酸鹽緩沖溶液(豬腎傳代細胞系(巢式技術(反轉錄聚合酶鏈式反應(24臨床癥狀與病理變化豬群中被檢豬出現下列臨床癥狀時，可作為綜合診斷定性的依據之一：a)發(fā)病急、病死率高；b)體溫≥40.5℃或間歇性發(fā)熱；c)精神萎靡、畏寒、厭食甚至廢食，嘔吐、步態(tài)不穩(wěn)或跛行；d)先便秘后腹瀉，或便秘和腹瀉交替出現；e)腹部皮下、鼻鏡、耳尖、四肢內側均可出現紫色出血斑點，指壓不褪色，結膜炎；f)懷孕母豬有流產、死胎、“木乃伊”胎或所產仔豬有衰弱、震顫、痙攣、發(fā)育不良等現象。4.2病理變化對臨床檢出的可疑患豬可進行病理學診斷，下述肉眼可見的病理變化可作為綜合診斷定性的依據之一：a)淋巴結水腫、出血，呈現紅白相間“大理石樣變”；b)腎臟呈土黃色，表面可見出血點，部分病例可見雀斑腎；c)全身漿膜、黏膜和心臟、膀胱、膽囊、扁桃體均可見出血點和出血斑；d)脾臟不腫大，表面有點狀出血或邊緣出現突起的楔狀梗死區(qū)；e)慢性CSF在回腸末端、盲腸和結腸常見“紐扣狀”潰瘍。易感豬出現4.1或4.2的情況，可判定為疑似CSF。確診應采集有臨床癥狀或病理變化的豬的扁桃體、脾臟、腎臟、胰臟、回腸、回盲瓣、腸系膜淋巴結和頜下淋巴結等組織（若無法采集組織，也可采集抗凝全血，但會大大降低檢測的敏感性）按實驗室病原學診斷方法進行確診。5樣本的采集、保存、運輸和處理5.1.1扁桃體活體采樣箱（包括鼻捻子、開5.1.6醫(yī)用EDTA抗凝采血管。5.1.8組織勻漿器或研磨器。5.2.1MEM培養(yǎng)液。3酒精見5.3樣品采集5.3.1活體動物扁桃體的采集采集活體豬扁桃體時，用鼻捻子固定豬上唇，用開口器打開口腔，用采樣槍采集扁桃體樣本，放入離心管中并編號。5.3.2活體動物抗凝全血的采集采用75%酒精對待采血動物頸部前腔靜脈表面皮膚進行擦拭消毒。用無菌注射器于前腔靜脈采血，立即注入醫(yī)用EDTA抗凝采血管，充分混勻后編號備用。5.3.3組織樣品采集病死豬可采集扁桃體、淋巴結、胰臟、脾臟、回腸、肝臟和腎臟等含毒量較高的組織臟器。若組織或臟器出現了典型的病理變化，宜采集病健交界處的組織，不宜采集病變嚴重且出現繼發(fā)感染（如細菌污染）的組織。采樣時用無菌的剪刀和鑷子剪切至少1g,裝入一次性自封袋或離心管，編號。5.4保存與運輸采集的樣本應放入主容器密封后，采用保溫容器加冰袋或干冰密封，應在8h之內運送到實驗室。樣本相關生物安全標識和運送流程應按照NY/T541的相關規(guī)定執(zhí)行。樣本到達實驗室后，在2℃~8℃條件下保存應≤24h。若需長期保存，應放置于超低溫冰箱(≤-70℃),避免反復凍融。5.5樣本處理樣本處理的生物安全措施按GB19489規(guī)定的相關操作進行。5.5.2組織樣本的處理將病料用無菌眼科剪和眼科鑷進行修剪（病灶與健康組織的交界處處理不同組織病料應更換手套并消毒操作器械。取1g大小的病料組織，置于無菌離心管中，再向其中加入無菌MEM培養(yǎng)液（含2%雙抗）1mL。在2℃~8℃溫度下置于勻漿機中勻漿，將勻漿液于4℃溫度下8000r/min離心5min,取上清，置于另一個無菌離心管中，待檢。5.5.3抗凝全血的處理將抗凝全血樣本直接分裝于無菌離心管中，在4℃下8000r/min離心5min,取上清，置于另一個無菌離心管中，待檢。6實驗室病原學診斷方法本方法快速、特異，可用于檢測扁桃體、淋巴結、脾臟、胰臟、腎臟和回腸遠端等組織樣品的冰凍切片4或觸片以及細胞培養(yǎng)物中的病毒抗原。樣本需在無防腐劑的冷藏條件下運送，但樣本不能凍結。根據FITC標記的抗體不同，可分為直接法和間接法。6.1.2.3濕盒（帶蓋子的長方形容器，底部鋪一層濕紗布）。微量移液器(丙酮預冷。6.1.3.5抗體：直接法采用FITC標記的抗CSFV的單克隆或多克隆抗體；間接法采用抗CSFV的單克隆或多克隆抗體及相應的FITC標記二抗。6.1.4.1將待檢的組織樣本制成冰凍切片或觸片，將液體吸干后用預冷的丙酮固定5min~10min,自然干燥；細胞培養(yǎng)物棄去孔中液體，用PBS緩沖液漂洗3次后，自然干燥，每孔加入適量固定液固定30min。每個樣本應做3個重復切片或觸片。固定后用PBS緩沖液漂洗3次，自然干燥。同時采用陽性組織和陰性組織進行相同處理，分別作為陽性對照和陰性對照。a)直接法：滴加工作濃度的FITC標記的抗CSFV的單克隆或多克隆抗體，覆蓋于樣本表面，置濕盒避光作用用b)間接法：滴加工作濃度的抗CSFV的單克隆或多克隆抗體，覆蓋于樣本表面，置37℃濕盒作用1h后，用PBS緩沖液洗滌3次，再加入工作濃度的FITC標記二抗，置37℃濕盒避光作用用6.1.4.3將組織切片放置室溫干燥5min,于組織樣本表面滴加適量緩沖甘油，用蓋玻片覆蓋樣本；細胞培養(yǎng)物表面滴加適量PBS緩沖液。將樣本直接置于倒置熒光顯微鏡下觀察結果。6.1.4.4實驗成立條件和結果判定：當細胞胞漿中出現亮綠色熒光著染時，判為染色陽性；細胞胞漿無著染，判為染色陰性。當陽性對照為染色陽性，陰性對照為染色陰性時，實驗結果成立。待檢樣本的3個重復切片或觸片中至少一個出現染色陽性時，即判該樣本為CSFV陽性；否則，判為陰性。6.2免疫過氧化物酶試驗（IPT）本方法原理與FAT相似，但抗體標記物為HRP,根據標記的抗體不同，可分為直接法和間接法。在普通光學顯微鏡下可觀察結果，且細胞板或組織切片能長期保存、反復觀察。5抗體：直接法采用HRP標記的抗CSFV的單克隆或多克隆抗體，間接法采用抗CSFV的單克隆或多克隆抗體及相應的HRP標記二抗。底物顯色液見A.5。其他試劑按照執(zhí)行6.2.4.2染色方法，以下兩種可任選其一：a)直接法：滴加工作濃度的HRP標記的抗CSFV的單克隆或多克隆抗體，覆蓋于樣本表面，置濕盒避光作用用b)間接法：滴加工作濃度的抗CSFV的單克隆或多克隆抗體，覆蓋于樣本表面，置37℃濕盒作用1h后，用PBS緩沖液洗滌3次，再加入工作濃度的HRP標記二抗，置37℃濕盒避光作用用6.2.4.3組織樣本表面滴加適量底物顯色液，室溫反應，待出現紅褐色顯色時，棄去底物顯色液，用蒸餾水漂洗，終止顯色反應。6.2.4.4將組織切片放置室溫干燥5min,于組織樣本表面滴加適量緩沖甘油，用蓋玻片覆蓋樣本；細胞培養(yǎng)物表面滴加適量PBS緩沖液。樣本直接置于普通光學顯微鏡下觀察。6.2.4.5實驗成立條件和結果判定：當細胞漿中出現紅褐色著染時，判為染色陽性；細胞胞漿無著染，判為染色陰性。當陽性對照為染色陽性，陰性對照為染色陰性時，實驗結果成立。待檢樣本的3個重復中至少一個出現染色陽性時，即判該樣本為CSFV陽性；否則，判為陰性。6.3豬瘟病毒分離與鑒定2細胞培養(yǎng)瓶。微量移液器(一次性針式濾器(06.3.1.7倒置熒光顯微鏡(FAT染色）或普通光學顯微鏡(IPT染色）。6.3.2.3MEM培養(yǎng)液。66.3.2.11PK-15細胞，或對病毒敏感性不低于PK-15細胞的豬腎和豬睪丸傳代細胞系。消毒液見6.3.3.1細胞的制備：分離病毒前24h~36h制備細胞。用胰酶消化處于對數生長期的PK-15細胞單層，將所得細胞懸液以1500r/min離心5min,并用細胞生長液將細胞重懸，細胞計數器計數，調整細胞濃度至2×106個/mL,備用；也可取適量細胞懸液加入細胞培養(yǎng)瓶或24孔細胞培養(yǎng)板制備細胞單層，待細胞長至60%~70%鋪滿孔底時備用。濾，收集濾出液備用。6.3.3.3病毒接種和培養(yǎng)。以下2種接種方式可選其一：加入細胞培養(yǎng)瓶中，同時接種24孔細胞培養(yǎng)板2孔，每孔0.5mL;24孔細胞培養(yǎng)板上同時接種豬瘟兔化弱毒疫苗C株細胞毒作為陽性對照(9份細胞懸液和1份細胞毒）2孔和陰性對照(9份細胞懸液和1份PK-15細胞培養(yǎng)上清）2孔，每孔0.5mL。操作時一定要避免交叉污染。當接種完待檢樣本后，做好標記，置于37℃含5%二氧化碳溫箱中培養(yǎng)72h。b)單層細胞接種：待6.3.3.1中的細胞長至60%~70%細胞單層后，棄去細胞培養(yǎng)上清，按細胞培養(yǎng)液1/10體積加入處理后的待檢樣本（見6.3.3.2)于細胞培養(yǎng)瓶和24孔細胞培養(yǎng)板中，24孔細胞培養(yǎng)板中同時接種0.2mL陽性對照和陰性對照各2孔。置于37℃含5%二氧化碳溫箱中吸附1h,期間每隔15min晃動一次細胞瓶／板，使液體全部浸潤細胞，防止細胞過分干燥死亡。吸出孔中液體，棄于2%NaOH溶液中進行滅活，用無血清MEM培養(yǎng)液漂洗瓶／板中細胞3次。加入適量細胞維持液于細胞培養(yǎng)瓶或細胞培養(yǎng)板中（例如：25cm2細胞培養(yǎng)瓶加入5mL維持液，24孔細胞培養(yǎng)板加入維持液0.5mL~1mL);37℃含5%二氧化碳溫箱中6.3.3.4檢測和結果判定。病毒接種后72h,取出細胞培養(yǎng)板，吸出孔中液體于2%NaOH溶液中滅活。用PBS漂洗3次，置通風櫥下干燥5min,用-20℃預冷的固定液固定30min以上。棄去孔中固定液，PBS緩沖液漂洗3次?？刹捎?.1或6.2的方法進行檢驗和結果判定。6.3.3.5病毒傳代及擴大培養(yǎng)。如需對病毒陽性樣本進行擴大培養(yǎng)，取出接種樣本的細胞瓶反復凍融共2次，進行擴大培養(yǎng)，獲得第3代陽性培養(yǎng)物，凍存?zhèn)溆?。根據需要對獲得的陽性培養(yǎng)物進行病毒滴度測定（見附錄B)或基因分型等研究。如對檢測結果有疑問可按上述方法盲傳2代并進行檢測。6.4豬瘟病毒RT-檢測方法豬瘟病毒檢測方法按照執(zhí)行6.5豬瘟病毒實時熒光檢測方法豬瘟病毒實時熒光RT-PCR檢測方法按照GB/T27540執(zhí)行。7實驗室抗體檢測方法7.1豬瘟病毒中和試驗根據抗體標記物的不同，豬瘟病毒中和實驗可分為NIF和NPLA。77.1.1免疫熒光中和試驗（NIF）單道微量移液器(多道移液器(無菌移液器吸頭(7.1.1.2.3CSFV抗體陽性血清。7.1.1.2.4CSFV抗體陰性血清。7.1.1.2.6豬瘟兔化弱毒疫苗C株細胞毒。7.1.1.3.1細胞的準備：用96孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)PK-15細胞，待細胞鋪滿孔底60%~70%時，備用。血清的滅活：用移液器吸取100μL待檢血清、CSFV抗體陽性和陰性對照血清，分裝于無菌離心管中，一份血清換一個移液器吸頭。將分裝后的待檢血清和對照血清置于56℃水浴鍋中滅活30min。7.1.1.3.3病毒的稀釋：在血清滅活期間，取適量已知毒價的豬瘟兔化弱毒疫苗細胞毒（豬瘟病毒TCID50測定見附錄B),用含1%雙抗的無血清MEM培養(yǎng)液將病毒稀釋至200TCID50/0.1mL。7.1.1.3.4血清與病毒的中和：取1塊96孔細胞培養(yǎng)板（記為板Ⅰ),每孔加入含1%雙抗的無血清滅活后的待檢血清和對照血清按順序加入上述培養(yǎng)液中，每孔20μL,每份血清做2個重復。此時，待檢／對照血清均被稀釋5倍。血清稀釋后，向板Ⅰ中每孔加入箱中孵育1h。迅速加入板Ⅰ中對應孔中的血清-病毒混合液，每孔100μL。注：進行此步驟操作時，以兩列為單位進行操作，例如：先用多道移液器吸凈板Ⅱ中1列、2列細胞培養(yǎng)液，然后迅速從板Ⅰ中吸取1列、2列孔中液體加入板Ⅱ的對應孔中。將板置于含二氧化碳溫箱中孵育1取出板每孔加入維持液含87.1.1.3.8取出板Ⅱ,棄去孔中液體，用PBS緩沖液漂洗三次，在吸水濾紙上輕拍后，置于通風櫥下干燥每孔加入預冷的固定液放置以上。7.1.1.3.9細胞染色。棄去孔中固定液，PBS緩沖液漂洗3次?？刹捎弥苯臃ɑ蜷g接法進行細胞染色：a)直接法：用抗體稀釋液將FITC標記的CSFV單克?。嗫寺】贵w稀釋至工作濃度，每孔加入避光反應直接進入b)間接法：將CSFV多克?。瘑慰寺】贵w用稀釋液稀釋至工作濃度。向板Ⅱ中加入稀釋后的抗體，每孔加入50μL,37℃反應1h。取出板Ⅱ,棄去孔中液體。用PBS緩沖液漂洗3次。將FITC標記的二抗用抗體稀釋液稀釋至工作濃度，加入到板Ⅱ各孔中，每孔50μL,37℃避光反應7.1.1.3.10取出板Ⅱ當細胞胞漿中出現亮綠色熒光時，判為染色陽性；細胞胞漿無著染，判為染色陰性。CSFV抗體陽性對照血清均為染色陰性，陰性對照血清均為染色陽性時，實驗成立。血清的2個重復孔中，2孔均為染色陽性，則該血清判為CSFV抗體陰性；若2孔均為染色陰性，則該血清判為CSFV抗體陽性；若2孔中1孔為染色陽性、1孔為染色陰性，則該血清判為可疑，應重復檢測，若仍為疑似結果，則判為CSFV抗體陰性。7.1.2過氧化物酶聯(lián)中和試驗（NPLA）器材包括倒置光學顯微鏡、其他器材。其他器材按照執(zhí)行其他試劑按照執(zhí)行檢驗步驟按執(zhí)行。7.1.2.3.2細胞染色?？刹捎弥苯臃ɑ蜷g接法進行細胞染色：a)直接法：用抗體稀釋液將HRP標記的CSFV單克?。嗫寺】贵w稀釋至工作濃度，每孔加入避光反應b)間接法：將CSFV多克?。瘑慰寺】贵w用稀釋液稀釋至工作濃度。向板Ⅱ中加入稀釋后的抗體，每孔加入50μL,37℃反應1h。取出板Ⅱ,棄去孔中液體。用PBS緩沖液漂洗3次。將HRP標記的二抗用抗體稀釋液稀釋至工作濃度，加入到板Ⅱ各孔中，每孔50μL,37℃避光反應7.1.2.3.3取出板Ⅱ,棄去孔中液體。用PBS緩沖液漂洗3次。向各孔中滴加底物顯色液50μL,待陰性血清對照孔細胞出現紅褐色顯色時，棄去孔中液體，加入蒸餾水漂洗兩次，終止反應。7.1.2.3.5將板Ⅱ置于倒置光學顯微鏡下觀察。97.1.2.4實驗成立條件及結果判定當細胞胞漿中出現紅褐色著染時，判為染色陽性；細胞胞漿無著染，判為染色陰性。CSFV抗體陽性對照血清均為染色陰性，抗體陰性對照血清均為染色陽性時，實驗成立。血清的2個重復孔中，2孔均為染色陽性，則該血清判為CSFV抗體陰性；若2孔均為染色陰性，則該血清判為CSFV抗體陽性；若2孔中1孔為染色陽性、1孔為染色陰性，則該血清判為可疑，應重復檢測，若仍為疑似結果，則判為CSFV抗體陰性。7.2豬瘟病毒阻斷抗體檢測方法豬瘟病毒阻斷ELISA抗體檢測方法按照GB/T34729—2017執(zhí)行。7.3豬瘟抗體間接檢測方法豬瘟抗體間接ELISA檢測方法按照GB/T35906執(zhí)行。7.4豬瘟病毒化學發(fā)光抗體檢測方法溫箱。微量移液器(多道移液器(7.4.2.1CSFVE2蛋白：見GB/T34729—2017中附錄A,或采用等效抗原。7.4.2.9商品化試劑盒：可選擇商品化試劑盒。包被：將CSFVE2蛋白用包被液稀釋至0.1μg/mL,按100μL每孔加入到化學發(fā)光板中，37℃包被3h。包被結束后，棄去孔中液體，每孔加入洗滌液300μL,洗滌2次。封閉：每孔加入新鮮配制的封閉液300μL,37℃封閉2h。封閉結束后，棄去孔中液體，37℃、濕度≤40%環(huán)境下干燥3h。放入干燥劑，密封包裝，置2℃~8℃保存。7.4.3.3樣本稀釋和加樣：每次實驗需設置系列校準品6孔。首先在血清稀釋板上依次加入校準品1~校樣品6（見附錄C)各60μL,其余各孔依次加入待檢樣本各60μL,再向以上各孔均加入60μL酶結合物，震蕩混勻；每孔吸取100μL轉移至包被E2蛋白的化學發(fā)光板對應孔內。37℃溫箱中反應30min。吸取不同血清時需要更換吸頭。洗滌：棄去孔中液體，每孔加入300μL洗滌液，室溫放置3min,洗滌5次，甩干洗滌液。或用自動洗板機洗板5次。加底物和顯色：每孔加入50μL化學發(fā)光底物A和50μL的化學發(fā)光底物B,振蕩混勻。也可將化學發(fā)光底物A、B等比例混勻后取100μL加入到各孔。在18℃~26℃條件下避光靜置5min。7.4.3.6化學發(fā)光儀讀取發(fā)光值。7.4.3.7繪制校準曲線：以校準品發(fā)光值為縱坐標，對應的NCU為橫坐標，繪制校準品的四參數擬合曲線，將樣本的發(fā)光值代入校準曲線計算，即可得出樣本中CSFV抗體的含量(NCU/mL)。7.4.3.8結果判定：如果樣本中抗體含量<20NCU/mL,樣本應判定為陰性；如果樣本中抗體含量≥20NCU/mL,則判定為陽性。8綜合判定8.1臨床癥狀與病理變化判定為典型的疑似豬病料，按6.1或6.2檢測為CSFV抗原陽性，或按6.3分離出CSFV,或按6.4和6.5檢測出CSFV核酸，同時與流行病學史相符合，均可判定為CSF陽性。8.2臨床癥狀與病理變化無明顯特征的疑似豬的病料，按6.1或6.2檢測為CSFV抗原陽性，或按6.3分離出CSFV（一般需盲傳培養(yǎng)或按6.4和6.5檢測出CSFV核酸，同時與流行病學史相符合，均可判定為CSF陽性。8.3若臨床癥狀與病理變化的診斷結果與6.1或6.2,或與6.4和6.5不符合，按6.3分離出CSFV,可判定為CSF陽性。8.4從未暴發(fā)過CSF的場（地區(qū)臨床癥狀與病理變化判定為典型的疑似豬的病料，至少需要6.1~6.38.5若待檢病料按第6章檢測為CSFV抗原陽性，需判斷是否為CSFV野毒感染或疫苗免疫所致。如待檢病料采自50d內未免疫過豬瘟疫苗的動物，可判定為野毒感染；若50d內免疫過豬瘟疫苗，應采用6.4方法對陽性病料進行核酸擴增，并對目的片段進行測序，與豬瘟病毒兔化弱毒疫苗株進行序列比對，確定基因亞型，最終鑒別診斷。8.6臨床癥狀與病理變化無明顯特征的未免疫且無母源豬瘟抗體的動物，按7.1、7.2、7.3或7.4任一項檢測出CSF抗體的，可判定該動物曾經或正在感染CSFV。CSF抗體檢測，檢測結果為陽性的，判定為疫苗免疫合格。附錄A（規(guī)范性附錄）A.1雙抗儲液(100倍）青霉素鏈霉素無菌蒸餾水無菌定量分裝，于-20℃保存。A.275%酒精無水乙醇（分析純）75mL無菌蒸餾水25mL室溫保存。A.3PBS緩沖液氯化鈉氯化鉀磷酸氫二鈉磷酸二氫鉀加去離子水800mL,充分溶解后，用濃鹽酸將pH值調節(jié)至7.4,去離子水定容至1000mL。高壓滅菌室溫保存。A.4緩沖甘油無水碳酸鈉加100mL蒸餾水或去離子水，充分溶解，調節(jié)pH值至9.0~9.3,與等量甘油（分析純）充分混合即可。A.5底物顯色液3,3-二氨基苯聯(lián)胺50mg值充分溶解，加入30%雙氧水10μL~30μL,現用現配。也可采用等效的商品化顯色試劑盒。A.6胰酶胰酶胰蛋白酶無菌緩沖液將胰酶加于PBS緩沖液中，4℃低溫、低速過夜攪拌溶解，用0.22μm一次性濾器過濾分裝存。也可采用等效的商品化試劑。A.7細胞生長液MEMFBS雙抗儲液于2℃~8℃保存。A.8病毒維持液MEM490mLFBS雙抗儲液于2℃~8℃保存。A.9固定液于-20℃保存。A.10抗體稀釋液馬血清2mLPBS緩沖液oHNaOH水充分溶解，室溫保存。A.12包被液碳酸鈉碳酸氫鈉蒸餾水800mL攪拌溶解，調節(jié)pH值至9.6,再加蒸餾水定容至1000mL。A.13封閉液酪蛋白蔗糖PROCLIN-300蒸餾水定容至1000mLA.14洗滌液十二水合磷酸氫二鈉二水合磷酸二氫鈉氯化鈉加去離子