CCSB46中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T19423—2003飼料中尼卡巴嗪的測(cè)定Dz2020-12-14發(fā)布2021-07-01實(shí)施國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)Ⅰ本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件代替GB/T19423—2003《飼料中尼卡巴嗪的測(cè)定高效液相色譜法》，與GB/T19423—2003相比，除編輯性修改外，主要技術(shù)變化如下：—增加了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法（見(jiàn)第5章—更改了高效液相色譜法的檢出限，增加了定量限（見(jiàn)第1章，2003年版的第1章—更改了高效液相色譜法的提取和凈化方法（見(jiàn)4.5.1、4.5.2,2003年版的7.1);—更改了高效液相色譜法的試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理（見(jiàn)4.6,2003年版的7.4)。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由全國(guó)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC76)提出并歸口。本文件起草單位：廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品公共監(jiān)測(cè)中心、浙江省獸藥飼料監(jiān)察所、貴州省獸藥飼料檢測(cè)所。1飼料中尼卡巴嗪的測(cè)定本文件描述了飼料中尼卡巴嗪的高效液相色譜和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。本文件適用于配合飼料、濃縮飼料和添加劑預(yù)混合飼料中尼卡巴嗪的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4高效液相色譜法試樣中的尼卡巴嗪用甲醇-乙腈混合溶液提取，經(jīng)MAX固相萃取小柱凈化后，用高效液相色譜儀檢測(cè)，外標(biāo)法定量。4.2試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?一級(jí)。4.2.3提取溶液：甲醇＋乙腈=50+50。80mL44mL4100mL,4-18℃24-18℃410mL80% 4.3.1高效液相色譜儀：配紫外檢測(cè)器／二極管陣列檢測(cè)器。4.3.3渦漩混合器。4.3.5超聲波清洗機(jī)。4.3.6冷凍離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于8000r/min。4.3.7固相萃取裝置。磨口瓶中保存，備用。4.5試驗(yàn)步驟取20min,每隔5min充分振蕩一次。于8000r/min離心5min。取上清液于50mL離心管中，殘?jiān)?5mL415mL進(jìn)行測(cè)定。液相色譜儀測(cè)定。4.5.3.1高效液相色譜參考條件流動(dòng)相：乙腈＋水=50+50。流速：1.0mL/min。柱溫：30℃。3檢測(cè)波長(zhǎng)：350nm。4.5.3.2標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和試樣溶液測(cè)定在儀器的最佳條件下，分別取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(4.2.9)和4.5.2得到的試樣溶液上機(jī)測(cè)定。尼卡巴嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液的高相液相色譜圖見(jiàn)附錄A。以保留時(shí)間定性，試樣溶液中尼卡巴嗪保留時(shí)間應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中尼卡巴嗪的保留時(shí)間一致，其±2.5%以尼卡巴嗪標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)不應(yīng)低于0.99。試樣溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液中尼卡巴嗪的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍內(nèi)，如超30%。4.6試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理試樣中尼卡巴嗪的含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)。多點(diǎn)校準(zhǔn)按公式(1)計(jì)算，單點(diǎn)校準(zhǔn)按公式(2)計(jì)算：式中：。式中：A—試樣溶液中尼卡巴嗪的峰面積；As—標(biāo)準(zhǔn)溶液中尼卡巴嗪的峰面積；。測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。45液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法試樣中的尼卡巴嗪用甲醇-乙腈混合溶液提取，經(jīng)MAX固相萃取小柱凈化后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。5.2試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?一級(jí)。5.2.3提取溶液：甲醇＋乙腈=50+50。4mL55-18℃5-18℃5.3儀器設(shè)備5.3.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜：配有電噴霧離子源。5.3.3渦漩混合器。5.3.4超聲波清洗機(jī)。5.3.5冷凍離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于8000r/min。5.3.6固相萃取裝置。磨口瓶中保存，備用。選取與待測(cè)樣品類(lèi)型相同，均勻一致，且在待測(cè)物保留時(shí)間處儀器響應(yīng)值小于方30%5.5試驗(yàn)步驟55次。于8000r/min離心5min。取上清液于100mL容量瓶中，殘?jiān)?5mL提取溶液(5.2.3)重復(fù)提52mL進(jìn)行測(cè)定。5mL4%55.5.3基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的制備稱(chēng)取基質(zhì)空白試樣，按照5.5.1和5.5.2處理得到空白試樣溶液。取適量的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(5.2.8),柱溫：30℃。流速：0.3mL/min。流動(dòng)相：A：水；B：乙腈。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。表1梯度洗脫程序時(shí)間ABmin%%00020454680電離方式：電噴霧電離，負(fù)離子模式(ESI-)。檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。毛細(xì)管電壓：4.5kV。離子源溫度：400℃。脫溶劑溫度：526℃。6尼卡巴嗪的定性、定量離子對(duì)及其他參考質(zhì)譜條件等見(jiàn)表2。表2尼卡巴嗪的定性、定量離子對(duì)及其他參考質(zhì)譜條件被測(cè)物名稱(chēng)監(jiān)測(cè)離子對(duì)m/≈錐孔電壓V碰撞能量eV尼卡巴嗪a為定量離子。5.5.4.3基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和試樣溶液測(cè)定在儀器的最佳條件下，分別取基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(5.5.3)和5.5.2得到的試樣溶液上機(jī)測(cè)定。尼卡巴嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液定量離子質(zhì)量色譜圖見(jiàn)附錄B。在相同試驗(yàn)條件下，試樣溶液與基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中尼卡巴嗪的保留時(shí)間相對(duì)偏差應(yīng)在度接近的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中對(duì)應(yīng)的定性離子的相對(duì)離子豐度，若偏差不超過(guò)表3規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對(duì)應(yīng)的尼卡巴嗪。表3定性測(cè)定時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差%>50≤10%±20±25±30±50以尼卡巴嗪基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)不應(yīng)低于0.99。試樣溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液中尼卡巴嗪的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍內(nèi)，如超出線性范圍，應(yīng)重新試驗(yàn)或?qū)⒃嚇尤芤汉突|(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液用提取溶液(5.2.3)稀釋?zhuān)ㄏ♂尡稊?shù)過(guò)30%。5.6試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理試樣中尼卡巴嗪的含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)。多點(diǎn)校準(zhǔn)按公式(3)計(jì)算，單點(diǎn)校準(zhǔn)按公式(4)計(jì)算：式中：7。式中：A—試樣溶液中尼卡巴嗪的峰面積；As—標(biāo)準(zhǔn)溶液中尼卡巴嗪