一、標(biāo)準(zhǔn)制定意義

（一）介紹

黃曲霉毒素屬于二呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌铮浞肿咏Y(jié)構(gòu)中含有1個二呋喃環(huán)和1個氧

雜萘鄰?fù)ㄏ愣顾兀┉h(huán)。黃曲霉毒素難溶于水、己烷、石油醚，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、

二甲基甲酰胺等有機溶劑。在中性溶液中較穩(wěn)定，在強酸性溶液中稍有分解，易被堿或強氧

化劑破壞，在pH值9~10的強堿溶液中會迅速分解成無毒的鹽。純品為無色結(jié)晶，耐高溫，

分解溫度為268℃，紫外線對低濃度黃曲霉毒素有很強穩(wěn)定作用?，F(xiàn)已分離出AFB1、AFB2、

AFG1、AFG2、AFB2a、AFG2a、AFM1、AFM2、AFP1等18種之多，其中以AFB1的毒性和

致癌性最強。

黃曲霉毒素的產(chǎn)毒菌廣泛存在于花生、玉米、麥類、稻谷等糧食作物的籽粒及核桃、杏

仁等干果、禽蛋、肉、甘薯、大豆粕、奶及奶制品中。對動物有劇烈急性毒性和明顯慢性毒

性，具有很強致突變、致畸和致癌作用。AFB1是迄今為止人類所知的毒性和致癌性最強的

物質(zhì)之一，其急性毒性約為三氧化二砷的68倍、氰化鉀的10倍。其損害肝臟，容易引發(fā)肝

炎、肝硬化、肝壞死等病癥。亞洲和非洲的疾病研究機構(gòu)的研究表明，食物中黃曲霉毒素與

干細(xì)胞癌變呈正相關(guān)性，長時間食用含低濃度黃曲霉毒素的食物被認(rèn)為是導(dǎo)致肝癌、胃癌、

腸癌等疾病的主要原因。黃曲霉毒素在體內(nèi)還具有一定的蓄積性，長期攝入低劑量的黃曲霉

毒素能夠大大增加患肝癌的幾率。此外，黃曲霉毒素與其他致病因素（如肝炎病毒等）對人

類疾病的誘發(fā)具有疊加效應(yīng)，其細(xì)胞毒作用可干擾信息RNA和DNA的合成，進而干擾細(xì)

胞蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致動物全身性損害。

（二）背景

據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計，全世界每年谷物產(chǎn)量的25%受到真菌毒素不同程度的

污染。隨著飼料工業(yè)的快速發(fā)展，近年來，中國的飼料也受到霉菌污染的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。自2006

年以來，玉米等飼料原料價格普遍上漲，致使很多飼料企業(yè)及養(yǎng)殖戶使用低質(zhì)飼料原料，加

上近年來氣候的變化，華北、東北地區(qū)降雨量增加，進一步加重了飼料原料中真菌毒素的污

染。而由于飼料原料和配合飼料中多種真菌毒素同時存在，在食用油等產(chǎn)品及牛奶中真菌毒

素污染也比較嚴(yán)重。在世界許多地方，目前真菌毒素已構(gòu)成重要的食品安全問題。

真菌毒素對人類和動物健康可產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，這一認(rèn)識導(dǎo)致了許多國家在近幾十年來

制定了諸多有關(guān)食品和飼料中真菌毒素的法規(guī)，以保護人類的健康，并保障生產(chǎn)者和貿(mào)易商

的經(jīng)濟利益。隨著全球經(jīng)濟一體化的進程，類似真菌毒素等涉及安全衛(wèi)生項目的限量標(biāo)準(zhǔn)，

越來越多地被利用為貿(mào)易保護主義中非關(guān)稅壁壘的重要手段。因此，為了保證食品安全，保

障消費者的健康，為了打破國外的技術(shù)壁壘，同時在合理有利的前提下，更多地樹立我國的

技術(shù)性壁壘，開展飼料中真菌毒素的檢測并建立標(biāo)準(zhǔn)方法是有效的方法之一。目前國內(nèi)應(yīng)用

標(biāo)準(zhǔn)檢測方法大多為儀器方法，所需儀器設(shè)備昂貴，不利于進行廣泛推廣，并且限制了很多

檢測單位高效、廣泛地開展檢測工作。建立符合中國國情的快速檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，具有檢測快

速、簡便、靈敏、成本低等優(yōu)點，為打開市場并占領(lǐng)市場提供了先決條件。

（三）限量標(biāo)準(zhǔn)、檢測方法及研究現(xiàn)狀

1、限量標(biāo)準(zhǔn)

國際上，在1966年WHO/FAO率先規(guī)定了世界貿(mào)易流通食品中AFB1的最高允許量，

1

其中明確規(guī)定國際貿(mào)易的谷類作物中AFB1的含量必須在15μg/kg以下，超過此標(biāo)準(zhǔn)含量的

產(chǎn)品將不能投放于市場進行流通和食用。英國在1933年規(guī)定，供人類消費前需加工的進口

農(nóng)產(chǎn)品中AFB1含量必須低于10μg/kg，供人類消費的農(nóng)產(chǎn)品AFB1的含量低于4μg/kg。美國

在1994年重新將黃曲霉毒素的限量進行調(diào)整：用于飼養(yǎng)家禽、豬、牛、羊的花生谷物等制

品中黃曲霉毒素總量不得超過100μg/kg，飼養(yǎng)幼年產(chǎn)奶動物的飼料中黃曲霉毒素的總量不

超過20μg/kg；兩年后，美國聯(lián)邦政府再次規(guī)范了黃曲霉毒素食品相關(guān)的安全法律，使其對

食品或動物飼料中黃曲霉毒素的含量要求更為嚴(yán)格，它規(guī)定人類消費食品和奶牛飼料中的黃

曲霉毒素總含量必須低于15μg/kg，人類消費的牛奶中AFB1含量要低于0.5μg/kg，其他動

物飼料中黃曲霉毒素的含量要低于30μg/kg。最為嚴(yán)格的規(guī)定為歐盟國家，國家要求人類生

活的食品消費品中AFB1的含量均不能超過2μg/kg。我國目前對AFB1的限量為特殊性膳食

食品中為0.5μg/kg，其他食品和飼料中AFB1的限量依據(jù)不同來源而有所不同，飼料詳細(xì)標(biāo)

準(zhǔn)見表1。

表1我國飼料中的AFB1限量標(biāo)準(zhǔn)

產(chǎn)品名稱限量/(μg/kg)

玉米、花生餅（粕）、棉籽餅（粕）、菜籽餅（粕）≤50

豆粕≤30

仔豬配合飼料及濃縮飼料≤10

生長肥育豬、種豬配合飼料及濃縮飼料≤20

肉用仔雞前期、雛雞配合飼料及濃縮飼料≤10

肉用仔雞后期、生長雞、產(chǎn)蛋雞配合飼料及濃縮飼料≤20

肉用仔鴨前期、雛鴨配合飼料及濃縮飼料≤10

肉用仔鴨后期、生長鴨、產(chǎn)蛋鴨配合飼料及濃縮飼料≤15

鵪鶉配合飼料及濃縮飼料≤20

奶牛精料補充料≤10

肉牛精料補充料≤50

2、檢測方法及研究現(xiàn)狀

真菌毒素的檢測方法主要有兩種，一是將色譜技術(shù)作為基礎(chǔ)的物理化學(xué)檢測方法，包括

高效液相色譜法（HPLC）和氣相色譜法（GC）等，而薄層層析法（TLC）由于操作過程太

復(fù)雜，國際上近些年使用這種方法檢測真菌毒素的情況越來越少；二是免疫化學(xué)檢測法，主

要指免疫親和柱法（IAC）以及酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等。

GC可同時檢測多種真菌毒素且檢測限較低，但仍存在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不理想、測定

時需要進行衍生化、上一次進樣待測物品滯留、重復(fù)進樣變異系數(shù)大使得重現(xiàn)性較差等一系

列問題。HPLC法雖可精確進行定性定量測定，但是樣品前處理較為繁瑣、儀器昂貴而成本

高，同時需要專門的技術(shù)操作人員，因而一般用于大型企業(yè)、科研院校和專業(yè)檢測機構(gòu)的定

量分析。ELISA檢測黃曲霉毒素，樣品前處理步驟簡單且可實現(xiàn)定量化，但這種生物學(xué)方

法，受環(huán)境因素影響大，所用抗體和酶特別容易發(fā)生變質(zhì)，如今市場上的同一物質(zhì)試劑盒檢

測結(jié)果差異性較大，穩(wěn)定性還有待提高。

2

相比較而言，膠體金免疫層析法無需大型儀器、所需輔助試劑少、交叉反應(yīng)率低、試紙

條易于保存且可單份測定，避免了分析步驟繁瑣、成本高等缺點，而且因其檢測更快速、操

作更簡單，測試人員無需進行專業(yè)培訓(xùn)，所以更適合食品安全快速檢測行業(yè)的快速檢驗和基

層檢測，尤其是野外和偏遠(yuǎn)地區(qū)人員現(xiàn)場應(yīng)用此項技術(shù)十分方便。

（四）制定標(biāo)準(zhǔn)的必要性和意義

1、提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量的需要

黃曲霉毒素B1是由產(chǎn)毒真菌產(chǎn)生的代謝物，廣泛存在于糧油食品和飼料中。這些產(chǎn)毒

真菌分布于各級食物鏈，即使是在現(xiàn)今擁有先進的農(nóng)業(yè)技術(shù)和食品加工工藝的條件下，在作

物種植、收獲、儲藏和加工過程中，仍然無法避免和防止產(chǎn)毒真菌的危害。隨著我國經(jīng)濟快

速發(fā)展，人民群眾物質(zhì)文化生活水平不斷提高，對食品安全的關(guān)注進一步提高，迫切需要相

應(yīng)的檢測技術(shù)，鑒于傳統(tǒng)檢測方法的專業(yè)性要求高和成本昂貴的缺點，黃曲霉毒素B1快速

檢測技術(shù)的研究及制訂相應(yīng)的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)是非常必要的。

2、實現(xiàn)以人為本，保證廣大群眾生命健康的需要

黃曲霉毒素B1毒性很高，可通過污染谷物和那些來源于被黃曲霉毒素B1污染了的飼料

喂飼的動物性食物（如牛奶、肉和蛋）而進入食物鏈，危害人類健康。其具有致突變、致癌

性，還具有免疫毒性，其作用的靶器官主要為肝臟，可引起人類和動物的肝臟病變和致癌。

為了對國家、人民高度負(fù)責(zé)，保障人民生命安全和農(nóng)村社會穩(wěn)定，研究黃曲霉毒素B1快速

檢測技術(shù)并制訂相應(yīng)的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)是非常必要的。

3、適應(yīng)市場經(jīng)濟和加入WTO新形勢的需要

我國已經(jīng)加入WTO，我國農(nóng)產(chǎn)品已面臨國際和國內(nèi)兩個市場，為我國農(nóng)產(chǎn)品（勞動密

集型）進入國際市場提供了很好的機遇，但國際上十分重視農(nóng)產(chǎn)品的安全問題，而農(nóng)產(chǎn)品易

于被真菌污染，可能存在黃曲霉毒素B1等真菌毒素殘留問題，這已成為影響出口創(chuàng)匯的最

大制約因素。由于毒素殘留超標(biāo)，引起外國拒收，退貨、扣留、索賠、撤消合同等事件經(jīng)常

發(fā)生，給我國農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)者造成很大損失，并影響了我國農(nóng)產(chǎn)品的形象。為了從源頭保證農(nóng)

產(chǎn)品質(zhì)量，提高我國農(nóng)產(chǎn)品的競爭力，研究黃曲霉毒素B1快速檢測技術(shù)并制訂相應(yīng)的檢測

方法標(biāo)準(zhǔn)是非常必要的。

二、標(biāo)準(zhǔn)制定過程

《飼料原料中黃曲霉毒素B1的快速篩查膠體金免疫層析法》標(biāo)準(zhǔn)由江西省獸藥飼料監(jiān)

察所、北京勤邦生物技術(shù)有限公司、雙胞胎（集團）股份有限公司、江西正邦科技股份有限

公司負(fù)責(zé)起草編寫。根據(jù)國家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定和修訂工作的要求，標(biāo)準(zhǔn)起草單位在《飼料原料

中黃曲霉毒素B1的快速篩查膠體金免疫層析法》的起草編制過程中，主要工作包括以下幾

個方面：

（1）詳細(xì)查閱了國內(nèi)、國外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)專業(yè)期刊上發(fā)表過的參考文獻等技術(shù)資料，

并對這些資料進行了詳細(xì)的對比，從方法的先進性、可靠性和實用性等幾個方面考慮，選取

了幾個代表性的參考資料作為標(biāo)準(zhǔn)起草中的主要技術(shù)參考文本。

（2）及時購置相關(guān)的實驗試劑、標(biāo)準(zhǔn)品和其他材料；已將AFB1與丙二胺反應(yīng)得到具

有氨基官能團的半抗原；將AFB1半抗原與牛血清白蛋白和卵清蛋白分別進行偶聯(lián)得到免疫

原和包被原；已將制備獲得的抗原通過免疫小鼠獲得AFB1單克隆抗體；建立了膠體金免疫

3

層析法的反應(yīng)體系，摸索不同條件對方法進行最優(yōu)化，最終確定了最佳的檢測方法。

（3）開展多種飼料原料膠體金快速檢測方法的試驗，包括小麥、大米、黃豆、玉米、

豆粕、花生粕、DDGS，這是方法的重要步驟和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。不同樣品用同一種方法進行試驗

和驗證，確保本檢測方法能夠靈敏、特異、準(zhǔn)確地檢測出飼料原料中AFB1的含量。如：方

法的靈敏度，按照空白飼料原料樣品及2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg四種濃度對飼料

原料進行添加，確定檢測限；方法的準(zhǔn)確率，通過對經(jīng)驗證的陰陽性樣品進行檢測，得到本

檢測方法的假陰性率和假陽性率，盲樣測定與儀器方法的結(jié)果進行比對，確保本方法的檢測

結(jié)果可靠；方法的特異性，運用本方法對飼料原料中常見的其他真菌毒素進行檢測，確保本

方法能特異性地檢測飼料原料中AFB1殘留。

（4）在技術(shù)指標(biāo)完成試驗工作之后，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)的格式，起草編寫標(biāo)準(zhǔn)文本內(nèi)容和

編制說明內(nèi)容。

三、標(biāo)準(zhǔn)制定依據(jù)

本標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》、GB/T

20001.4-2015《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第4部分：試驗方法標(biāo)準(zhǔn)》的要求而進行編寫的。有關(guān)技術(shù)

內(nèi)容是在參考國外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及文獻的基礎(chǔ)上經(jīng)研究、改進和驗證后制定的。

四、標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)內(nèi)容和技術(shù)指標(biāo)的論證

（一）技術(shù)原理

本方法應(yīng)用了競爭抑制免疫層析原理。將氯金酸用還原法制成一定直徑的金溶膠顆粒，

標(biāo)記抗體。硝酸纖維素膜為載體，利用了微孔膜的毛細(xì)管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢

向另一端滲移。在移動的過程中，會發(fā)生相應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)，并通過免疫金的顏色而顯示

出來。樣本中的黃曲霉毒素B1在流動的過程中與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制了抗

體和硝酸纖維素（NC）膜檢測線上黃曲霉毒素B1-BSA偶聯(lián)物的結(jié)合，使檢測線不顯顏色，

結(jié)果為陽牲；反之，檢測線顯紅色，結(jié)果為陰性。

（二）膠體金免疫方法主要材料的制備

1、半抗原的合成及鑒定

AFB1為小分子物質(zhì)，不具備免疫原性，只有反應(yīng)原性，因此需要與大分子共價結(jié)合后

才能使動物免疫系統(tǒng)識別，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，本實驗首先需要合成小分子半抗原與蛋白質(zhì)偶

聯(lián)的人工抗原。

AFB1小分子半抗原的制備既要保留其基本結(jié)構(gòu)特征，同時又要很好地與大分子蛋白結(jié)

合。本項目通過AFB1小分子結(jié)構(gòu)改造獲得具有氨基官能團的半抗原，與牛血清白蛋白（BSA）

偶聯(lián)合成免疫原，與卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)合成包被原。

將AFB1與丙二胺反應(yīng)得到具有氨基官能團的半抗原，合成路線如下：

4

半抗原合成的具體步驟：0.10gAFB1在2mL二甲基亞砜（DMSO）中的混合物，60℃

下緩慢滴加入0.1mL1,3-丙二胺和0.1mL吡啶在2mLDMSO的混合液中，滴加完畢后，繼

續(xù)反應(yīng)12h，旋蒸除去溶劑和未反應(yīng)的丙二胺，定量得到AFB1的丙二胺單縮合物，即為AFB1

半抗原。

2、人工抗原的合成及鑒定

（1）免疫原的合成

將AFB1半抗原與BSA進行偶聯(lián)得到免疫原。

具體操作如下：

取AFB1半抗原20mg用2mL水溶解，得到溶液（Ⅰ），取0.5mL3%的戊二醛逐滴加入

到上述溶液（Ⅰ）中，室溫攪拌反應(yīng)24h得到溶液（Ⅱ）；取50mgBSA用4mL水溶解得到

溶液（Ⅲ）；將溶液（Ⅱ）緩慢加入到溶液（Ⅲ）中，室溫攪拌反應(yīng)過夜，再向攪拌后的溶

液中加入30mgNaBH4進行還原反應(yīng)；用0.02mol/L的PBS透析三天，每天更換透析液三次，

得到AFB1免疫原。

（2）包被原的合成

將AFB1半抗原與OVA進行偶聯(lián)得到包被原。

具體操作如下：

取50mgOVA用4mL水溶解，得到溶液（Ⅰ）；取EDC和NHS各50mg用2mL水溶

解完全后加入溶液（Ⅰ）中，室溫攪拌反應(yīng)30min，得到溶液（Ⅱ），取25mgAFB1半抗原

用3mL水溶解，得到溶液（Ⅲ）；將溶液（Ⅱ）緩慢加入到溶液（Ⅲ）中，室溫攪拌反應(yīng)

24h；用0.02mol/L的PBS將攪拌后的溶液透析3天，每天更換透析液3次，得到AFB1包

被原。

（3）AFB1免疫原與包被原的鑒定

一般通過紫外掃描法鑒定半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)是否為有效偶聯(lián)，因為半抗原與蛋白

在紫外下有不同的特征吸收，當(dāng)偶聯(lián)成功時，偶聯(lián)物的紫外吸收會有二者的迭加效應(yīng)出現(xiàn)，

因此比著單獨的蛋白特征吸收會發(fā)生一定的偏移，可用于檢測偶聯(lián)是否成功。

偶聯(lián)比的測定

用pH7.4的PBS溶液稀釋AFB1半抗原、牛血清白蛋白、卵清蛋白和兩種蛋白與AFB1

半抗原的結(jié)合物，配制成一定濃度的溶液，然后用紫外分光光度計進行全波長掃描，得到它

們的紫外吸收光譜圖。

根據(jù)公式K=A/CL分別計算出AFB1半抗原、牛血清白蛋白、卵清蛋白的摩爾消光系數(shù)。

5

在載體蛋白和AFB1半抗原的最大波長處檢測偶聯(lián)物的光吸收值，按公式計算兩種物質(zhì)在偶

聯(lián)物中的摩爾濃度比，即偶聯(lián)比：

Ca/Cb=（A偶264×KBSA280-A偶280×KBSA264）/（A偶280×KAFB1264-A偶264×KAFB1280）

蛋白含量的測定

將偶聯(lián)物稀釋到適當(dāng)倍數(shù)后，測定280nm和260nm的分光光度值，按公式計算蛋白的

濃度即偶聯(lián)物的濃度：

蛋白質(zhì)（mg/mL）=1.45×OD280-0.74×OD260

免疫原和包被原的鑒定結(jié)果

通過紫外掃描法鑒定半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)是有效偶聯(lián)，根據(jù)AFB1半抗原、載體蛋

白、偶聯(lián)物在特定波長的摩爾吸光系數(shù)估算半抗原與載體蛋白的結(jié)合比分別為15:1和18:1，

偶聯(lián)效果較好。

3、抗體的制備

（1）動物免疫

用無菌pH7.0的PBS液將合成的免疫原溶解，然后按免疫原（AFB1半抗原-BSA）與弗

氏佐劑（FCA）1:3的比例充分乳化制成油乳劑疫苗。首次免疫用弗氏完全佐劑疫苗，對8~10

周齡Balb/c小鼠進行免疫，頸背部皮下多點注射，免疫劑量為150μg/只。14天后二免，采

用弗氏不完全佐劑（FICA），免疫劑量同上；28天后三免，采用弗氏不完全佐劑，免疫劑量

同上；31天后加強免，不加佐劑，直接采用AFB1半抗原-BSA免疫。免疫過程見表2。

表2動物免疫過程

免疫過程免疫原免疫劑量/(μg/只)間隔時間

首免AFB1半抗原-BSA（FCA）150-

二免AFB1半抗原-BSA（FICA）15014天

三免AFB1半抗原-BSA（FICA）15014天

加強免（融合前三天）AFB1半抗原-BSA1003天

（2）單克隆抗體的制備

飼養(yǎng)細(xì)胞制備：斷頸處死8~10周齡Balb/c小鼠，浸泡在75%酒精中5min，隨即放入

超凈工作臺內(nèi)，腹部朝上放于平皿內(nèi)或固定于解剖板上。用眼科鑷子夾起小鼠腹部皮膚，用

剪刀剪一小口，注意切勿剪破腹膜，以免腹腔液外流和污染。然后用剪刀向上下兩側(cè)做鈍性

分離，充分暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器吸取5mLRPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，

注入小鼠腹腔，輕輕抽回注射器，晃動小鼠腿部和尾部幾次。用原注射器抽回腹腔內(nèi)液體，

注入離心管。如此反復(fù)操作3~4次。1000r/min離心10min，棄上清。用20~50mL完全培養(yǎng)

液重懸細(xì)胞，100μL/孔滴加到培養(yǎng)板，置培養(yǎng)箱備用。

脾細(xì)胞制備：加強免疫后3天，取免疫Balb/c小鼠一只，眼眶采血后脫臼處死，在75%

酒精中消毒后取脾臟，去除結(jié)締組織，制備脾細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，加RPMI1640

至30mL，1500~2000r/min離心5min，棄上清，加RPMI1640至30mL，計數(shù)待用。

6

骨髓瘤細(xì)胞制備：取3瓶生長狀態(tài)良好的（活細(xì)胞數(shù)>95%）骨髓瘤細(xì)胞，將之完全吹

下，轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，加RPMI1640至30mL，1500~2000r/min離心5min，棄上清，

加RPMI1640至30mL，計數(shù)待用。

細(xì)胞混合：脾細(xì)胞:骨髓瘤細(xì)胞=8:1，混合，1500~2000r/min離心5min。

細(xì)胞融合：將混合好的細(xì)胞離心，倒干上清，把沉淀細(xì)胞塊彈成糊狀，置37℃水浴，

在1min內(nèi)加入1mL融合劑，融合劑為聚乙二醇（PEG）4000，作用2min，并輕輕攪拌細(xì)

胞，在隨后4min內(nèi)加入20mL無血清的PEG營養(yǎng)液，1000r/min離心10min，棄上清。用

20~50mL完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，鋪種于含飼養(yǎng)細(xì)胞96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μL，置培養(yǎng)

箱中。

上清檢測：待細(xì)胞長至孔底的1/2~1/3時，采用間接競爭ELISA法測定細(xì)胞上清液，篩

選陽性孔。將陽性細(xì)胞在檢測后2天內(nèi)采用有限稀釋法進行亞克隆。10~14天后，再取細(xì)胞

上清檢測，最終得到了穩(wěn)定分泌AFB1的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，將此細(xì)胞株進行擴大培養(yǎng)和

傳代。

老鼠致敏：液體石蠟致敏Balb/c小鼠，6~8周，注射體積500μL/只。10天后可制備腹

水。

注射細(xì)胞：收集雜交瘤細(xì)胞并用1640洗細(xì)胞兩遍，取100到150萬細(xì)胞注射于老鼠腹

腔，一周后可見老鼠狀態(tài)不活躍并且老鼠的腹腔腫大。

腹水采集：注射細(xì)胞一周后對腹腔腫大的老鼠用無菌注射器于老鼠腹腔采集腹水，每隔

一到兩天采集一次，這樣多次反復(fù)采集直到老鼠自然死亡。

單抗純化：采集到的腹水，用辛酸-飽和硫酸銨法進行純化，純化后的腹水放入-20℃環(huán)

境保存，腹水在使用前經(jīng)過0.01mol/LNaCl于4℃環(huán)境下透析48h，中間每隔6~8h換液一

次。

4、膠體金的制備

（1）玻璃器皿的準(zhǔn)備

用于實驗的所有玻璃器皿在實驗之前需要徹底清潔：將玻璃器皿先用自來水沖洗去除玻

璃器皿表面的灰塵，用酸液浸泡36h后，取出，用自來水洗凈酸液，再用蒸餾水洗3~4次，

再用去離子水把每個玻璃器皿洗三次，烤箱烘干后備用。專用的玻璃器皿用第一次生成的膠

體金穩(wěn)定其表面，棄去后以雙蒸水洗凈，可以減少金顆粒的吸附，玻璃器皿的表面污染會干

擾金顆粒的生成。

（2）檸檬酸三鈉還原法

取0.01%氯金酸水溶液100mL置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續(xù)高

溫、持續(xù)攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉水溶液2mL，繼續(xù)勻速攪拌加熱15min，溶液呈透

亮的紅色。室溫冷卻，用去離子水恢復(fù)到原體積，4℃保存。

（3）膠體金的質(zhì)量鑒定

肉眼觀察：用肉眼觀察制備的膠體金，其顏色為酒紅色、均勻度較好無雜質(zhì)、透明度較

高，說明膠體金質(zhì)量較好，結(jié)果見圖1。

7

圖1肉眼觀察膠體金顏色

紫外掃描鑒定：取冷卻后的膠體金溶液進行400~600nm紫外掃描，確定最大吸收峰波長，

觀察最大吸收峰的峰形、峰寬，結(jié)果見圖2。其圖譜中最大吸收峰的峰寬較小，說明膠體金

顆粒分布比較均勻，最大吸收峰波長為523nm。

圖2膠體金的紫外/可見分光光度計掃描圖

透射電鏡鑒定：透射電鏡下觀察膠體金顆粒的大小是否均勻一致，有無橢圓形及多角形。

拍片放大后測量膠體金顆粒直徑大小，取多個點計算膠體金顆粒的平均直徑。膠體金顆粒的

透射電鏡掃描圖片見圖3。由圖3可知，在透射電鏡下觀察到膠體金顆粒的大小基本一致，沒

有橢圓形、多角形的金顆粒。將照片掃描后轉(zhuǎn)換成電子版圖片，放大后測量膠體金顆粒直徑

大小。隨機挑選10個膠體金顆粒通過計算得到金顆粒平均直徑為(20±0.5)nm。

8

圖3膠體金電鏡掃描圖片

（4）膠體金溶液的準(zhǔn)備

用0.1mol/LK2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值為7.2。由于金顆粒容易吸附于電極上使之堵

塞，故不能用pH計測定膠體金溶液的pH值，一般使用精密pH試紙。

5、膠體金標(biāo)記抗體的制備

（1）穩(wěn)定膠體金最適抗體用量的選擇

以目測法確定穩(wěn)定膠體金的最適抗體用量。用0.1mol/LK2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH為7.2，

分裝9管，每管1mL。待標(biāo)記的抗體溶液用0.01mol/L，pH7.6的磷酸鹽緩沖液作系列稀釋為

50~400μg/mL，分別取0.1mL加入2~8管的膠體金溶液中。第1管加0.1mL三蒸水，混勻。靜

置5min后，在上述1~8管中加入0.1mL10%NaCl溶液，第9管加0.1mL三蒸水，混勻后靜置2h，

觀察結(jié)果。稀釋后抗體和其他試劑操作步驟見表3，結(jié)果見表4和圖4。

表3最適蛋白用量操作步驟

管數(shù)

試劑

123456789

抗體加樣量（mL）0.10.10.10.10.10.10.10.10.1

抗體濃度（μg/mL）050100150200250300350400

膠體金（mL）1.01.01.01.01.01.01.01.01.0

搖勻，靜置5min

10%NaCl（mL）0.10.10.10.10.10.10.10.10

搖勻，靜置2h后，觀察結(jié)果

備注：第1管為沒有加入抗體的對照管，其內(nèi)加入0.1mL三蒸水，第9管為沒有加入氯化鈉的對照管，其內(nèi)加

入0.1mL三蒸水。

表4目測法確定穩(wěn)定膠體金最適蛋白用量

管號123456789

蛋白添加量（μg）0510152025303540

9

終顏色藍(lán)灰藍(lán)灰藍(lán)灰紅藍(lán)紅紅紅紅紅

圖4膠體金與抗體比例試驗結(jié)果

由表4和圖4可知，未加抗體蛋白（1管）和加入抗體蛋白的量不足以穩(wěn)定膠體金的2~4

管，呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象；未加入氯化鈉的9管顏色不發(fā)生變化；而加入抗體蛋白量達(dá)

到或超過穩(wěn)定膠體金的最小蛋白用量的5~8管保持紅色不變。其中含抗體蛋白量最低的5號試

管即含穩(wěn)定1mL膠體金所需的最小蛋白用量。在此基礎(chǔ)上再增加20%即為待標(biāo)記抗體蛋白的

實際用量，即穩(wěn)定膠體金的實際蛋白用量為每1mL膠體金溶液中添加24μg抗體蛋白。

（2）膠體金標(biāo)記抗體程序

在磁力攪拌下，用0.1mol/LK2CO3調(diào)節(jié)膠體金的pH至7.2，按每毫升膠體金溶液中加入

抗體24μg的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶液中加入AFB1單克隆抗體，攪拌混勻10min，加入10%BSA使其

在膠體金溶液中的終濃度為1%，靜置10min。12000r/min，4℃離心40min，棄上清液，沉淀

物用體積為初始膠體金體積1/10的金標(biāo)抗體稀釋液（含0.5%的牛血清白蛋白、0.3%的表面活

性劑、10%的蔗糖，pH7.2的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液）重懸，置4℃環(huán)境中備用。

（3）膠體金標(biāo)記抗體的鑒定

將羊抗鼠二抗點樣于NC膜上，直接與金標(biāo)抗體作用，可見有明顯的粉紅色斑點，表明

金標(biāo)抗體有活性。

（三）膠體金免疫方法的建立

1、固相載體的選擇

（1）吸水墊的選擇

取厚度為2.59nm，質(zhì)地均勻的Cottonlinters300作為吸水墊組裝試紙條，滴加樣品后

5min觀察吸水墊的情況，樣品吸收速度較快，故選擇Cottonlinters300作為吸水墊。

（2）硝酸纖維素膜的選擇

將抗原適當(dāng)稀釋后通過點樣方式分別包被在milipore135、UnisartCN140和mdi70三種

NC膜上，經(jīng)干燥、組裝試紙條后，置于陰性樣品中測試觀察樣品層析速度和檢測線顯色情

況，結(jié)果見表5。

表5NC膜點樣顯色結(jié)果

NC膜型號millipore135UnisartCN140mdi70

10

顯色情況＋＋＋＋＋＋＋

注：＋＋＋，表示著色很深，與背景反差很大；＋＋，表示著色較深或著色很深但與背景反差較?。唬?，

表示著色淡或著色較深但與背景反差很小；－，表示沒有著色，或與背景色沒有反差，表6-表22同此注釋。

由表5可知，不同孔徑及廠家的NC膜點樣后，均能顯色，但顯色程度略有不同，

UnisartCN140顯色最深，milipore135和mdi70差別不大。

不同NC膜組裝的試紙條加樣后樣品展開速度和加樣5min后的檢測線顯色結(jié)果見表6。

表6NC膜層析顯色結(jié)果

NC膜型號millipore135UnisartCN140mdi70

試劑展開速度較快慢快

5min后檢測線顯色情況＋＋＋＋＋＋＋

由表6可知，UnisartCN140加入樣品后層析速度較慢，5min內(nèi)檢測線顯色最深，milipore

135試劑展開速度較UnisartCN140快，但不及mdi70。milipore135與mdi70上檢測線顯色情

況相差不多，但mdi70背景顏色較淺。所以，綜合層析速度與顯色情況，三種NC膜中，mdi

70更符合試紙條設(shè)計要求。

（3）樣品墊的選擇

分別取BX-SB06、WFB、QXLM三種不同材質(zhì)材料作為樣品墊組裝試紙條，在金標(biāo)墊

處滴加2μL10%的金標(biāo)抗體，滴加100μL的陰性豆粕樣品，觀察樣品墊對樣品的過濾、吸收，

以及樣品在NC膜上的層析和檢測線顯色情況，結(jié)果見表7。

表7樣品墊選擇結(jié)果1

樣品墊型號BX-SB06WFBQXLM

樣品吸收情況吸收不完全吸收不完全吸收完全

檢測線顯色情況－－＋

由表7可知，BX-SB06、WFB對豆粕中各組分吸收能力非常差，使用這兩種材料作為

樣品墊檢測豆粕時檢測線沒有顯色。QXLM雖然可以較大程度地吸收、過濾豆粕的蛋白等

物質(zhì)，但對于豆粕的層析速度的提高還是有較大局限性，層析速度較慢，且顯色較淺。以上

實驗說明采用卡殼形式測定豆粕等飼料原料時，使用以上三種樣品墊對于飼料原料中復(fù)雜組

分的吸收過濾效果均不顯著，除非采取稀釋的方法，否則很難得到滿意的效果。但將樣品稀

釋后再進行檢測，不但會降低產(chǎn)品本身的靈敏度，而且增加了操作步驟，使試紙條便捷快速

的優(yōu)勢大打折扣。所以，考慮其他反應(yīng)模式對飼料原料進行檢測。

向潔凈的酶標(biāo)板孔中加入10μL10%的金標(biāo)抗體，再將陰性豆粕樣品200μL加入其中，

與孔內(nèi)金標(biāo)抗體混合均勻，分別取BX-SB06、WFB、QXLM三種材質(zhì)材料作為樣品墊組裝

試紙條后，手持吸水紙?zhí)?，將樣品墊端插入盛有樣品-金標(biāo)抗體混合液中豎直放置，靜置5min

后觀察結(jié)果。

11

表8樣品墊選擇結(jié)果2

樣品墊型號BX-SB06WFBQXLM

樣品吸收情況吸收不完全吸收不完全吸收完全

檢測線顯色情況＋＋＋＋＋

由表8可知，采用插條方式進行檢測時BX-SB06、WFB對豆粕中各組分吸收效果依然

較差，雖然檢測線稍有顯色，但顯色很淺。QXLM作為樣品墊在插條模式中顯示出了極大

的優(yōu)勢，不但對樣品過濾效果較好，而且層析速度相對快速，檢測線顯色明顯。這種直接向

酶標(biāo)板孔中滴加樣品的模式，操作簡便。所以，選擇QXLM作為樣品墊，并采用插條模式

進行檢測。

2、層析條件的選擇

（1）包被稀釋液和包被條件的篩選

分別用A、B、C、D四種不同配方的稀釋液將包被原AFB1半抗原-OVA做一定梯度稀釋，

在NC膜上點樣后烘干，組裝試紙條檢測陰性豆粕樣品，觀察顯色情況，結(jié)果見表9。

表9包被稀釋液篩選結(jié)果

包被原濃度包被液

（mg/mL）ABCD

0.025－－－＋

0.5＋＋＋＋＋

1＋＋＋＋＋＋＋＋＋

2＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

由表9可知，使用不同的包被稀釋液，試紙條顯色結(jié)果有一定差異，其中包被稀釋液D

在稀釋至0.025mg/mL時，NC膜上點樣著色照樣很深，而其他包被稀釋液在稀釋至

0.025mg/mL時，顏色很淡或不顯色，故選擇包被稀釋液D作為實際用包被稀釋液。

用包被稀釋液D將包被原稀釋至1mg/mL，在NC膜上點樣后分別置于37℃烘干和室溫

（18~25℃）下自然干燥，時間設(shè)置為30min、1h、2h、8h、12h，組裝試紙條檢測陰性豆粕

樣品，觀察顯色情況，結(jié)果見表10。

表10包被條件篩選結(jié)果

包被時間

包被條件

30min1h2h8h12h

37℃＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

室溫（18~25℃）＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

由表10可知，點樣后，包被稀釋液在37℃烘干和室溫（18~25℃）自然干燥的不同包被

12

時間差異不顯著。為減少外界因素對試驗的影響，包被條件選擇37℃干燥8h。

（2）封閉液和封閉條件的選擇

為減少NC膜對反應(yīng)的非特異性影響，采用封閉液對NC膜進行封閉，分別用A、B、C、

D四種封閉液封閉，37℃溫育30min后，用PBST洗液清洗2次，自然干燥后組裝試紙條檢測

陰性豆粕樣品，觀測膠體金在NC膜上的層析情況及檢測線的顯色情況，結(jié)果見表11。

表11封閉液篩選結(jié)果

封閉液ABCD

顯色情況＋＋＋＋＋＋＋

由表11可知，封閉液A封閉后得到的斑點顏色很深，作為背景的NC膜呈白色，同斑點

顏色反差非常大，說明封閉液A封閉效果很好，將NC膜上的一些結(jié)合位點進行了封閉，使

金標(biāo)抗體不在NC膜上結(jié)合停留，除抗原點樣處為紅色外，NC膜其他位置都為白色。封閉液

C封閉后得到的斑點顏色也很深，但NC膜上呈深淺不一的粉紅色，降低了斑點同背景的反

差。封閉液B、D封閉后得到的斑點顏色較淺。說明封閉液A的封閉效果比其他三種封閉液

封閉效果好。

包被抗原點樣后，用封閉液A以不同的封閉時間30min、1h、2h、8h、12h分別在室溫

（18~25℃）、37℃條件下進行封閉，組裝試紙條檢測陰性豆粕樣品，觀察膠體金在NC膜上

的層析情況及檢測線的顯色情況，結(jié)果見表12。

表12封閉條件篩選結(jié)果

封閉時間30min1h2h8h12h

37℃＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

室溫（18~25℃）＋＋＋＋＋＋＋＋＋

由表12可知，抗原點樣后，37℃封閉2~12h和室溫條件下封閉12h均能得到著色較深、背

景較淺的斑點。為縮短試驗時間、減少外界因素對試驗的影響，選擇的封閉條件為37℃封閉

2h。

（3）金標(biāo)抗體稀釋液和干燥條件的篩選

分別用A、B、C、D、E五種不同配方的稀釋液將金標(biāo)抗體做1:1、1:2、1:3、1:4稀釋后，

組裝試紙條檢測陰性豆粕樣品，觀察顯色情況，結(jié)果見表13。

表13金標(biāo)抗體稀釋液篩選結(jié)果

金標(biāo)抗體稀釋液

稀釋倍數(shù)

ABCDE

1:1＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

1:2＋＋＋＋＋＋＋＋＋

1:3－＋＋＋＋－

13

1:4－－＋－－

由表13可知，五種金標(biāo)抗體稀釋液顯色結(jié)果差異顯著，分析結(jié)果顯示經(jīng)稀釋液C稀釋1:4

的金標(biāo)抗體滴加到NC膜上時仍能顯色，而同樣情況下，其他稀釋液不顯色，故選擇金標(biāo)抗

體稀釋液C作為實際用金標(biāo)抗體稀釋液。

用稀釋液C將金標(biāo)抗體稀釋到1:2，加入酶標(biāo)板孔中，選擇表14中的5種凍干條件進行凍

干機程序方案篩選。對比5種凍干方式所得結(jié)果如表15所示。

表14金標(biāo)抗體干燥條件篩選程序

程序編號

凍干條件

12345

預(yù)

凍-4℃30min0030min0

程

序-20℃1h1h01h0

-50℃3h3h3h3h3h

干

燥-20℃3h3h3h3h3h

程

序10℃00010h10h

25℃12h12h12h2h2h

表15金標(biāo)抗體干燥條件篩選結(jié)果

程序編號

12345

顯色情況＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

凍干狀態(tài)×○○×○

注：○，代表凍干狀態(tài)良好，形狀規(guī)則，干燥完全；×，代表凍干狀態(tài)不能滿足生產(chǎn)需求，形狀不規(guī)則，

干燥不完全。

由表15可知，凍干程序4、5顯色均較好，3次之，1、2顯色較淺。凍干狀態(tài)2、3、5較好，

呈規(guī)則形狀，干燥完全，1、4凍干不完全，成“蜂窩”狀，容易吸潮而影響顯色。綜合顯色

與凍干狀態(tài)，選擇5號程序作為金標(biāo)抗體干燥條件，與金標(biāo)抗體稀釋液C配合使用。

（4）樣品墊展開劑的篩選

配制A、B、C、D、E五種不同展開劑作為樣品墊處理液，并將液體處理到QXLM上，

組裝試紙條后配合已凍干的金標(biāo)抗體使用，對比五種展開劑對膠體金層析速度、樣品流動性

的作用及顯色情況。結(jié)果見表16。

表16樣品墊展開劑篩選結(jié)果

展開劑種類

ABCDE

14

顯色情況＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

層析速度

180165150175176

（樣本到達(dá)吸水墊的時間/s）

由表16可知，不同展開劑對樣品的流動速度及顯色差異較大。大體規(guī)律為層析速度越快，

金標(biāo)抗體與C、T線有越充足的時間結(jié)合則顯色越深，不過展開劑D的層析速度較A快，但顯

色比A淺，這可能是由于D中加入的表面活性劑影響了AFB1抗原抗體的結(jié)合。綜合考慮層析

速度與顯色情況，選擇展開劑C作為樣品墊處理液適宜。

（5）C、T線包被濃度及線寬的確定

利用已確定的包被稀釋液將抗原與二抗分別進行不同倍數(shù)稀釋，并制備成試紙條檢測，

測試結(jié)果顯示：二抗或抗原濃度太低時，試紙條上的C、T線顏色偏淺，不利于觀察；抗原

濃度太高則試紙條上T線太深，與C線對比反差明顯，且對檢測靈敏度有顯著影響。通過不

斷對比試驗，綜合考慮陰性顯色程度與陽性樣品添加測試，確定在層析材料上的抗原濃度為

0.12mg/mL，線寬為0.95μL/cm，二抗?jié)舛葹?.18mg/mL，線寬為1.0μL/cm。

（四）試紙條的組裝

試紙條的結(jié)構(gòu)如下所示：

加樣后的樣品流動方向

圖5膠體金試紙條結(jié)構(gòu)示意圖

圖6膠體金試紙條剖面結(jié)構(gòu)示意圖

注：1為樣品墊、2為NC膜、3為吸水墊、4為檢測線、5為質(zhì)控線、6為PVC底板、7為保護膜

樣品墊、NC膜和吸水墊依次按順序黏貼在PVC底板上，樣品墊的末端與NC膜的始端相

連，NC膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與

底板的末端對齊；試紙黏貼有保護膜，保護膜覆蓋在樣品墊上，為檢測端，上面印有MAX

字樣。

（五）試紙條檢測過程的優(yōu)化

1、樣品提取方法的研究

在研制本方法的過程中，盡量簡化樣品前處理的步驟，力求方法更加簡單、快速。對于

飼料原料樣品，一般需要簡單的過篩、粉碎過程。試驗摸索中發(fā)現(xiàn)，粉碎后的飼料原料樣品，

15

需加入提取液進行提取，將提取后的上清液加入到磷酸鹽緩沖液中，混勻后，點樣。具體試

驗過程如下：

（1）樣品提取液的選擇

取陰性豆粕樣品，及AFB1添加濃度分別為2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg的陽性豆

粕樣品，經(jīng)過篩和粉碎后，各稱取(5.00±0.01)g到50mL離心管中，分別加入15mL濃度為80%

的甲醇、氯仿、乙醇，渦動3min，室溫3000r/min以上離心5min；取100μL上清液加入200μL

0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液混勻后，取200L進行檢測，結(jié)果見表17。

表17樣品提取液的選擇

提取液

添加濃度

甲醇氯仿乙醇

0μg/kg＋＋＋—＋

2μg/kg＋＋—＋

5μg/kg＋——

10μg/kg———

20μg/kg———

由表17可知，氯仿作為提取液時，干擾T線顯色機制而導(dǎo)致T線不顯色；乙醇作為提取

液時，T線顯色淺；采用甲醇提取液，T線顯色深淺適中且梯度明顯，為最優(yōu)方案。

（2）樣品提取液體積的選擇

取陰性豆粕樣品，及AFB1添加濃度分別為2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg的陽性豆

粕樣品，經(jīng)過篩和粉碎后，各稱取(5.00±0.01)g到50mL離心管中，分別加入5mL、10mL、

15mL、20mL80%甲醇，渦動3min，室溫3000r/min以上離心5min；取100μL上清液加入200μL

0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液混勻后，取200L進行檢測，結(jié)果見表18。

表18樣品提取液體積的選擇

樣品提取液體積

添加濃度

5mL10mL15mL20mL

0μg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋＋

2μg/kg＋＋＋＋＋＋＋

5μg/kg＋＋＋＋

10μg/kg＋＋——

20μg/kg—＋——

由表18可知，樣品提取液體積為5mL、10mL時，提取不充分，使AFB1無法充分游離出

來，導(dǎo)致T線顯色淺且梯度不明顯；樣品提取液體積為15mL、20mL時，T線顯色無明顯差異，

考慮到實驗的經(jīng)濟性，選擇樣品提取液體積為15mL，T線顯色深淺適中且梯度明顯，為最優(yōu)

方案。

16

（3）樣本稀釋液的選擇

取陰性豆粕樣品，及AFB1添加濃度分別為2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg的陽性豆

粕樣品，經(jīng)過篩和粉碎后，各稱取(5.00±0.01)g到50mL離心管中，加入15mL80%甲醇，渦動

3min，室溫3000r/min以上離心5min；取100μL上清液加入200μL樣本稀釋液（A：0.01mol/L、

pH7.2的磷酸鹽緩沖液；B：0.02mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液；C：0.05mol/L、pH7.2的磷

酸鹽緩沖液；D：0.1mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液）混勻后，取200L進行檢測，結(jié)果見表

19。

表19樣本稀釋液的選擇

樣本稀釋液

添加濃度

ABCD

0μg/kg＋＋＋＋＋＋

2μg/kg＋＋＋＋＋

5μg/kg＋＋＋＋

10μg/kg—＋＋＋

20μg/kg————

由表19可知，采用B、C、D樣本稀釋液濃度過高，T線顯色淺，且不同濃度梯度下T線

顯色無明顯梯度；采用A樣本稀釋液時，T線顯色深淺適中且梯度明顯，為最優(yōu)方案。

（4）樣本稀釋液體積的選擇

取陰性豆粕樣品，及AFB1添加濃度分別為2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg的陽性豆

粕樣品，經(jīng)過篩和粉碎后，各稱取(5.00±0.01)g到50mL離心管中，加入15mL80%甲醇，渦動

3min，室溫3000r/min以上離心5min；取100μL上清液分別加入50μL、100μL、200μL、300μL

0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液混勻后，取200L進行檢測，結(jié)果見表20。

表20樣本稀釋液體積的選擇

樣本稀釋液體積

添加濃度

50μL100μL200μL300μL

0μg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋＋

2μg/kg＋＋＋＋＋＋＋

5μg/kg＋＋＋＋

10μg/kg＋＋—＋

20μg/kg—＋——

由表20可知，樣本稀釋液體積為50μL時，T線顯色淺且梯度不明顯；樣本稀釋液體積為

100μL時，顯色稍加深但梯度不明顯；當(dāng)樣本稀釋液體積為300μL時，檢測限濃度T線不消線；

當(dāng)樣本稀釋液體積為200μL時，T線顯色深淺適中且梯度明顯，為最優(yōu)方案。

由此可見，飼料原料樣品前處理方法為：試樣經(jīng)過篩、粉碎后，稱取(5.00±0.01)g至50mL

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離心管中，加入15mL80%甲醇，渦動3min，室溫3000r/min以上離心5min，取100μL上清液

加入200μL0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液，混勻，待檢。

2、孵育時間的研究

把金標(biāo)抗體凍干在微孔中，組裝試紙條，檢測樣品。檢測前需要使用200μL經(jīng)上述1處

理的待測樣品液加入微孔中充分溶解金標(biāo)抗體，分別孵育1min、2min、3min、5min、8min，

之后插入試紙條，液體流動時開始計時，反應(yīng)5min后觀察結(jié)果。

取陰性豆粕樣品，及AFB1添加濃度分別為2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg的陽性豆

粕樣品，用試紙條進行檢測，結(jié)果見表21。

表21孵育時間研究結(jié)果

孵育時間（min）

添加濃度

12358

0μg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

2μg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋

5μg/kg＋＋＋＋＋

10μg/kg＋＋＋—＋

20μg/kg—————

由表21可知，孵育時間為1min、2min、3min時，金標(biāo)抗體與樣品反應(yīng)不充分，T線顯色

淺，顯色梯度不明顯；樣品處理時間為5min、8min時，T線顯色無明顯差異，考慮到金標(biāo)抗

體與樣品反應(yīng)的充分性以及實驗的快速性，選擇孵育時間為5min，T線顯色深淺適中且梯度

明顯，為最優(yōu)方案。

3、顯色時間的研究

把金標(biāo)抗體凍干在微孔中，組裝試紙條，檢測樣品。檢測前需要使用200μL經(jīng)上述1處

理的待測樣品液加入微孔中充分溶解金標(biāo)抗體，孵育5min，之后插入試紙條，液體流動時

開始計時，分別反應(yīng)3min、5min、8min、10min、15min后觀察結(jié)果。

取陰性豆粕樣品，及AFB1添加濃度分別為2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg的陽性豆

粕樣品，用試紙條進行檢測，結(jié)果見表22。

表