DB13河北省地方標準DB13/T-2024羊肚菌菌種鑒定技術規(guī)程（網上征求意見稿）2024-6-21發(fā)布2024-7-20實施2024-6-21發(fā)布2024-7-20實施河北省市場監(jiān)督管理局發(fā)布前言本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》給出的規(guī)定起草。本文件由河北省農業(yè)農村廳提出。本文件主要起草單位：河北農業(yè)大學、河北匯珍食用菌有限公司本文件主要起草人:李守勉、王俊玲、龐立新、李肖、田景花、李國杰、李明、王民樂、張艷明、王田妹、張世青、李梅。本文件為首次發(fā)布。羊肚菌菌種鑒定技術規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了羊肚菌菌種鑒定技術的術語和定義、抽樣、菌種質量指標、菌種質量鑒定方法、判定規(guī)則、菌種標簽、包裝、運輸、貯存及檔案管理等。本文件適用于羊肚菌母種、原種和栽培種（以下簡稱“菌種”）的質量檢驗。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T191包裝儲運圖示標志GB/T12728食用菌術語GB/T30989高通量基因測序技術規(guī)程NY/T528食用菌菌種生產技術規(guī)程NY/T1284食用菌菌種中雜菌及害蟲的檢驗NY/T1742食用菌菌種通用技術要求NY/T1846食用菌菌種檢驗規(guī)程DB13/T5170日光溫室羊肚菌栽培技術規(guī)程3術語和定義

GB/T12728界定的以及下列術語和定義適用于本文件。3.1羊肚菌morchellaspp.隸屬子囊菌門（Ascomycota）、盤菌綱（Discomycetes）、盤菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌屬（Morchella），因其外表凹陷形似羊肚而得名，是一種著名的食藥兼用菌。3.2萌發(fā)時間germinationtime適宜環(huán)境條件下，從接種到接種塊在培養(yǎng)基上恢復生長的時間。3.3定植率colonizationrate接種塊轉接到培養(yǎng)基上后，萌發(fā)的接種塊數量占總接種塊數量的比例。3.4菌種純度spawnpurity指某一菌種只含有特定品種的菌絲體。3.5菌種活力spawnvigor指菌種萌發(fā)及吃料能力。3.6菌絲生長量mycelialgrowthincrement菌絲體在培養(yǎng)基質中的生長距離。4抽樣菌種的抽樣應符合NY/T1846的規(guī)定。5菌種質量指標5.1感官指標樣品的感官指標應符合表1的要求。表1 感指標項目要求菌絲體白色至淺黃色，生長旺盛，菌絲濃密緣整齊培養(yǎng)基緊貼瓶（管/袋）壁，無干縮菌絲體表面分泌物允許有少量無色或淡黃色至黃褐色水珠菌核允許有白色至黃褐色菌核菌絲生長量長滿培養(yǎng)基（試管/瓶/袋）氣味有羊肚菌菌種特有的香氣，無酸、臭、霉等異味原基無子實體無拮抗現象無角變無污染無5.2微生物學及蟲害指標應符合表2要求。表 微生物學和蟲害指標項目要求雜菌無害蟲無分生孢子有萌發(fā)時間（h）≤24h菌絲生長速度在溫度20℃條件下培養(yǎng)，平均生長速率應大于10mm/d。定植率（％）≥956菌種鑒定方法6.1感官鑒定應符合NY/T1846的規(guī)定。6.2雜菌及害蟲檢驗應符合NY/T1284的規(guī)定。6.3菌種真實性鑒定6.3.1菌絲體培養(yǎng)將待鑒定菌種活化，用直徑為6mm的打孔器取厚度為1mm~2mm的菌絲圓片1片，接種于去除瓊脂的PDA液體培養(yǎng)基中，菌絲面向上，20℃避光靜置培養(yǎng)5d～6d，收集菌絲體備用。6.3.2基因組DNA提取采用CTAB法提取羊肚菌菌種菌絲體基因組DNA，提取方法參見附錄A，DNA濃度應≥50ng/μL，A260/A280應為1.8~2.0。6.3.3PCR擴增采用真菌通用引物ITS1/ITS4：TCCGTAGGTGAACCTGCGG/TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR擴增體系和擴增程序參見附錄B。6.3.4電泳檢測將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄電泳條帶，黑色羊肚菌類群（包括梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌等）條帶大小應為800bp，且無其他雜帶，將樣品進行雙向測序，測序方法應符合GB/T30989的規(guī)定。6.3.5數據庫比對將測序結果在NCBI數據庫中進行Blastn比對（/），初步分析測序菌株的分類地位。6.3.5系統(tǒng)發(fā)育樹的構建下載已報道的羊肚菌ITS序列，用Bioedit、Sequence軟件對序列對比調整后，進行最大似然法(maximumlikelihood,ML)構建羊肚菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹，確定測序菌株的分類地位。適宜生產的羊肚菌菌種分類地位應為六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、梯棱羊肚菌等。6.4交配型基因鑒定采用CTAB法提取羊肚菌菌種菌絲體基因組DNA，采用黑脈羊肚菌交配型基因特異性引物MAT1-1、MAT1-2進行PCR擴增，PCR擴增體系和擴增程序參見附錄B。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄電泳條帶，MAT1-1-1和MAT1-2-1對應的條帶大小分別為800bp和500bp，生產用菌種應同時含有MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型基因。6.5菌種活力檢驗6.5.1平板繼代培養(yǎng)在直徑為9mm的培養(yǎng)皿PDA培養(yǎng)基中央接種抽檢菌種，接種塊大小約為（直徑）6mm×（厚）1mm~2mm，置于20℃避光培養(yǎng)2d～3d，當菌絲生長至距離培養(yǎng)皿邊緣約0.5cm時，用直徑6mm的打孔器取菌落尖端菌絲的菌絲圓片，轉接至新PDA平板培養(yǎng)基中央進行繼代培養(yǎng)。6.5.2菌種萌發(fā)檢驗菌種塊應在繼代培養(yǎng)約6h~12h內萌發(fā)。6.5.3定植率測定每個測試菌種接種50瓶（袋），接種后5d菌絲萌發(fā)且定植的數量n，定植率X計算公式如下：X=………………（1）式中：X——定植率，%n——定植的總瓶（袋）數量m——接種的總瓶（袋）數6.5.4菌絲生長速率測定在繼代培養(yǎng)1d、2d、3d時，采用十字交叉法分別測量菌落直徑，計算菌絲生長速率。羊肚菌菌絲平均生長速率應大于10mm/d。6.5.5菌絲生長勢檢驗菌落邊緣整齊，菌絲均勻一致，尖端菌絲健壯、分支清晰。6.5.6菌絲形態(tài)鏡檢繼代培養(yǎng)2d～3d后，采用10×40光學顯微鏡觀察主干菌絲與二級菌絲分枝的夾角，夾角應小于65°，在100倍熒光顯微鏡下觀察菌絲單個細胞內的細胞核數量不少于8個。應符合NY/T1846的規(guī)定。6.5.7菌核檢驗繼代培養(yǎng)8d～12d后，菌落表面應產生白色顆粒狀菌核，繼續(xù)培養(yǎng)菌核數量會增加，顏色由白色逐漸變成棕褐色；無菌核產生或菌核極少的菌種不宜用于生產。6.5.8菌落顏色檢驗繼代培養(yǎng)10d～15d，菌落顏色應為白色或淡黃色；菌落顏色呈黑褐色的菌種不宜用于生產。6.6栽培檢驗6.6.1場地要求選擇溫度、濕度、光照、通風等條件可控的出菇房、智能出菇箱或人工氣候培養(yǎng)箱等。6.6.2栽培方法宜采用塑料筐、塑料袋或床架覆土方式進行出菇試驗，每個樣品隨機設置3個重復，每個小區(qū)栽培面積應不少于3m2。栽培管理參見DB13/T5170。6.6.3菌種萌發(fā)檢驗播種24h菌種應萌發(fā)。6.6.4分生孢子檢驗菌絲應在播種5d～10d產生分生孢子，分生孢子潔白，均勻分布于土壤表面。6.6.5外源營養(yǎng)袋檢驗擺放外源營養(yǎng)袋20d～25d，袋內應長滿羊肚菌菌絲。6.6.6羊肚菌原基檢驗澆催菇水后7d~10d，土壤表面應分化出大量健壯原基，并應有分化為幼菇的趨勢。7判定規(guī)則7.1合格菌種感官檢驗、雜菌及害蟲檢驗、菌種真實性鑒定、交配型基因鑒定、菌種活力檢驗、栽培檢驗均符合要求的菌種為合格菌種。7.2不合格菌種感官檢驗、雜菌及害蟲檢驗、菌種真實性鑒定、交配型基因鑒定、菌種活力檢驗、栽培檢驗，以上任何一項指標不符合要求的，為不合格菌種。8菌種標簽、包裝、運輸、貯存應符合GB/T191和NY/T1742的規(guī)定。9檔案管理應建立羊肚菌菌種檢驗檔案，內容應包括但不限于感官檢驗、雜菌及害蟲檢驗、菌種真實性鑒定、交配型基因鑒定、菌種活力檢驗、栽培檢驗、菌種標簽、包裝、標志檢驗等內容，檔案應保存3年以上。 附錄A（資料性附錄）羊肚菌基因組DNA提取方法羊肚菌基因組DNA提取按照以下步驟進行：a）將菌絲體用加液氮充分研磨至粉末狀，稱取0.5g菌絲于2ml離心管中；b）加入750μL裂解液（CTAB2％，pH=8.0），65℃水浴裂解40min，每隔10min顛倒混勻1次；c）將離心管取出后冷卻至室溫后，加750μL的PCA（苯酚:氯仿:異戊醇=25∶24∶1），緩慢混勻，12000r/min離心10min；d）取500μL上清液轉置于新的2mL離心管中，加入等體積CA（氯仿:異戊醇=24∶1），緩慢混勻，12000r/min離心15min；e）取350μL上清液于新的1.5mL離心管中，加入等體積CA（氯仿:異戊醇=24∶1），-20℃靜置沉淀2h；f）12000rpm/min離心8min，棄上清液，留下的DNA沉淀中加入70%乙醇，震蕩清洗DNA沉淀，離心棄上清液；重復該過程2~3次后，放置于超凈工作中晾干沉淀；g）加入100μLTE緩沖液溶解沉淀，加入1.5μLRNaseA，37℃水浴1h，-20℃冷藏保存?zhèn)溆?。附錄B（資料性附錄）PCR擴增體系和擴增程序B.1羊肚菌菌種ITS測序鑒定PCR擴增體系和擴增程序B.1.1PCR擴增體系PCR擴增的總體積為50μL，其中10×PCRBuffer5μL，dNTPs5μL，引物ITS1/ITS4各1μL，Taq聚合酶0.5μL，模板DNA2μL，雙蒸水35.5μL。B.1.2PCR擴增程序94℃預變性5min；94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸60sec，30個循環(huán)；72℃延伸7min。B.2羊肚菌菌種交配型基因鑒定PCR擴增體系和擴增程序B.2.1PCR擴增體系PCR擴增的總體積為25μL，其中引物MAT1-1L/MAT1-1R（引物MAT1-2L/MAT1-2R）各1μL，Taq聚合酶12.5μL，模板DNA1μL，雙蒸水9.5μL。B.2.2PCR擴增程序94℃預變性3min；94℃變性20sec，58℃退火30sec，72℃延伸120sec，35個循環(huán)；72℃延伸7min。、、、、附錄C（資料性附錄）羊