T/CVMA161—2024牛分枝桿菌抗體鑭系熒光免疫層析法DetectionmethodofMycobacteriumbovisantibodybylanthanidefluorescenceimmunochromatographicassay2024-5-8發(fā)布2024-5-8實施中國獸醫(yī)協(xié)會發(fā)布I1本文件適用于檢測牛血清中牛分枝桿菌抗體，可用于牛結(jié)核病的輔2規(guī)范性引用文件NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范鑭系熒光免疫層析技術(shù)lanthanidefluorescBSA：牛血清白蛋白（BovineserumalbumNC膜：硝酸纖維素膜（NitrocellulosemembPVC：聚氯乙烯塑料材料（Polyvinylchlorid2算出血清中牛分枝桿菌抗體檢測值（T/C比帶入標準曲線的回歸公式，換算獲得牛分枝桿菌抗體效6.2配制0.2MPB液、10mM按照NY/T541中的規(guī)定進行樣品處理，血液樣品用離心機1000g離心3min，血按照NY/T541中規(guī)定進行血清或全血樣品的存放與運輸。血清樣品在2℃~8℃冷藏可保存24h，如需長期保存應(yīng)置-20℃或-80℃。采8檢測方法8.1牛分枝桿菌抗體鑭系熒光免疫層析檢測卡3避光置于16℃~26℃作用15min后，將檢測卡放入鑭系熒光分析儀檢測，系統(tǒng)自動完成讀值。進行牛分枝桿菌抗體實驗室檢測時，如檢測9結(jié)果計算便攜式鑭系熒光分析儀通過LED燈激發(fā)并收集檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）上的熒光信號，分析儀系統(tǒng)軟件自帶計算功能，將熒光信號值轉(zhuǎn)換成數(shù)值（T線和C線由T如果檢測值顯示數(shù)據(jù)，說明質(zhì)控線和檢測線熒光信號值4A.1質(zhì)控血清制備A.1.1牛分枝桿菌陽性血清的制備A.1.2牛分枝桿菌陰性血清的制備A.2熒光微球墊的制備A.2.1熒光微球標記牛分枝桿菌復(fù)合抗原的制備本品系將牛分枝桿菌的ESAT-6、CFP-10偏愛密碼子序列，合成了牛分枝桿菌多表位蛋白融合表達目的基表達載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-ECM，經(jīng)轉(zhuǎn)化構(gòu)建成埃希氏大腸桿菌基因工程菌pET-28a-ECM-純化后的牛分枝桿菌重組蛋白的蛋白濃度。每毫升蛋白濃度均應(yīng)不低于3mg。0.2MPB洗滌一次，16℃~26℃避光震蕩混勻，加入2mgEDC和2mgN-羥基琥珀亞胺對熒光微球活化30min，于16℃~26℃25000g離心30min，加1ml0.2MPB分散，加入0.1mg牛結(jié)核分枝桿菌復(fù)合抗原，16℃~26℃避光震蕩2h，加入封閉劑，16℃~26℃避光震蕩30min，25000g離心30min，棄上清，加1ml0.2MPB洗滌標記微球一次。最后用重懸液重懸至2ml，4℃避光保存?zhèn)溆?。A.2.2熒光微球質(zhì)量標準1）鑭系熒光微球液體避光保存，在2℃~8℃中呈乳白色。2）納米粒度儀檢測鑭系熒光微球粒徑280nm～320nm，粒徑分布均勻性檢驗分布半寬度應(yīng)<4）激發(fā)光波長380nm～400nm，發(fā)射光波長為615nm。A.2.3熒光微球墊的制備5將熒光微球標記牛分枝桿菌復(fù)合抗原稀釋5倍后，用h～3h，烘干后于切成7mm于4℃~30℃密封保存?zhèn)溆谩.3包被片材的制備A.3.1包被溶液的制備A.3.1.1質(zhì)控線（C線）包被溶液膜溶液，置于棕色玻璃瓶中，2℃~8℃保存?zhèn)溆?。A.3.1.2檢測線（T線）包被溶液包被溶液，置于棕色玻璃瓶中，2℃~8℃保存?zhèn)溆谩.3.2包被片材（T線），用連續(xù)點膜機分別將質(zhì)控線（C線）包被溶液、檢測線（T線）包被溶液包被在NC膜上的C封口，貼上標簽，于4℃~30℃密封保存?zhèn)溆?。A.4樣品墊的制備纖維素膜表面，置于37℃(±2℃)烘房過夜干燥，用切條機將其裁切為1.7cm×30cm，A.5檢測卡的制備在16℃~26℃及濕度≤30%RH的潔凈環(huán)境下操作，依次按吸水墊、熒光微球墊、樣品墊的順序?qū)⒛は噜徧幘?mm～2mm層疊，樣品墊一邊與PVC底板下沿對齊，并使包被片材上的檢測線