ICS65.020.30CCSICS65.020.30CCSB44內蒙古自治區(qū)地方標準DB15/T3551—2024呼倫貝爾羊種質資源冷凍保存技術規(guī)程TechnicalcodeofgermplasmresourcescryopreservationonHulunbeiersheep2024-07-152024-07-152024-08-15內蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB15/T3551—2024前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由內蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標準化技術委員會（SAM/TC19）歸口。IIDB15/T3551—2024呼倫貝爾羊種質資源冷凍保存技術規(guī)程范圍本文件適用于呼倫貝爾羊精液、卵母細胞和胚胎的冷凍保存。（GB/T26613呼倫貝爾羊NY/T1674牛羊胚胎質量檢測技術規(guī)程DB15/T1769綿羊冷凍精液DB15/T3401奶綿羊胚胎冷凍解凍技術規(guī)程3術語和定義3術語和定義GB/T26613界定的以及下列術語和定義適用于本文件。開放式拉長細管openpulledstraw卵母細胞和胚胎玻璃化冷凍保存的容器。胚胎保存液holding用于胚胎體外發(fā)育的一種商品化溶液。4縮略語下列縮略語適用于本文件。BSA：牛血清白蛋白（BovineSerumAlbumin）COCs：卵丘卵母細胞復合體（Cumulus-OocyteComplexes）DMSO：二甲基亞砜（DimethylSulfoxide）EG：乙二醇（EthyleneGlycol）FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）OPS：開放式拉長細管（OpenPulledStraw）1DB15/T3551—2024PBS：磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferedSolution）TS：玻璃化解凍液（ThawingSolution）VS：玻璃化冷凍液（VitrifiedSolution）5精液冷凍保存按照附錄A中表A.1規(guī)定的配方配制。標記按照DB15/T1769的規(guī)定執(zhí)行。精子活力≥70%、密度≥0.8×109個/mL、畸形率≤15%，顏色為乳白色。原精液用PBS稀釋5倍，緩慢攪拌，孵育5min，以600rpm離心10min，移除上清液。稀釋和平衡I2×108/4℃冰箱平衡2hII1×108個/毫升，再平衡1.5h。裝管在4℃條件下，將精液分裝到0.25mL細管中，另一端封口。冷凍利用程序冷凍儀，在4℃～-35℃溫區(qū)，設置6℃/min的降溫速率；在-35℃～-100℃的溫區(qū)，設置20℃/min的降溫速率，然后投入液氮。將液氮倒入深度50cm以上的泡沫箱預冷10min，細管鋪放在支架后放入泡沫箱，支架平面距離液氮面4cm，熏蒸7min，然后投入液氮。凍精細管以25支或50支包裝單位投入液氮罐。取出凍精細管，室溫空氣浴5s，然后放置于40℃水浴10s取出，無菌紙巾擦干備用。6卵母細胞冷凍保存2DB15/T3551—2024OPS法。324按照附錄A中表A.2規(guī)定的配方配制。冷凍OPS將0.25mL細管加熱變軟后拉成為管壁內徑為0.2mm，管壁厚0.02mm的OPS管，冷卻后用手術刀片在其細端切開，細端長度約2cm。2530min，100μL～200μL的VS1和VS2mlOPS6.4.3冷凍6.4.3冷凍將卵母細胞在VS1液中平衡30s，再移入VS2液中平衡不超過25s，將多枚卵母細胞及少量VS2吸入OPS中，投入液氮保存。解凍準備25℃至少預熱30min2mlTS1200μLTS1、TS2、TS33710min。解凍OST1mi，TS25TS353～50.5h～2h7胚胎冷凍保存冷凍方法程序冷凍儀法。胚胎選擇選擇1、2級桑葚胚至擴張囊胚，胚胎質量鑒定按照NY/T1674的規(guī)定執(zhí)行。3DB15/T3551—2024溶液配置按照附錄A中表A.3規(guī)定的配方配制。標記按照DB15/T3401的規(guī)定執(zhí)行。胚胎回收回收到裝有胚胎保存液并編號的平皿中。洗滌胚胎在胚胎保存液滴中洗4次，放入做好標記的平皿中，30min內必須開始冷凍。平衡胚胎在S1和S2液中平衡5min，在1.5M乙二醇中平衡10min。冷凍按照DB15/T3401的規(guī)定執(zhí)行。貯存將細管裝入相應的拇指管內，放入液氮罐中保存。解凍胚胎細管從液氮中取出，空氣浴2s～3s后，放入32℃水浴10s。把胚胎放入T液中平衡5min，然后把胚胎移入胚胎保存液平衡5min，并洗3次，備用。4A.3胚胎冷凍保存溶液配方見表A.3。表A.3胚胎冷凍保存溶液配方A.3胚胎冷凍保存溶液配方見表A.3。表A.3胚胎冷凍保存溶液配方5附錄A（資料性）種質資源冷凍保存溶液配方A.1。表A.1精液冷凍保存溶液配方種質資源溶液名稱配方精液冷凍保存稀釋液I液超純水80ml、葡萄糖2.80g、檸檬酸鈉2.0g、卵黃20ml、青霉素10萬單位、鏈霉素10萬單位冷凍保存稀釋液II液I液45ml、甘油5mlA.2。表A.2卵母細胞冷凍保存溶液配方種質資源溶液名稱配方卵母細胞基礎液mPBS液DPBS100ml、3.6mg丙酮酸鈉、0.1g葡萄糖、0.3g牛血清白蛋白FS液含有0.3g/ml聚蔗糖、0.17g/ml蔗糖的mPBS冷凍液VS1含7.5胎牛血清的mPBSVS2含牛血清的mPBS解凍液TS1含0.34g/ml蔗糖的mPBSTS2含0.17g/ml蔗糖的mPBSTS3含0.085g/ml蔗糖的mPBS卵母細胞培養(yǎng)液含5%（v/v）