ICS?FORMTEXT11.220FORMTEXTB44FORMTEXT?????DBFORMTEXT23DBFORMTEXT23/TFORMTEXTXXXXX—FORMTEXTXXXXFORMTEXT?????FORMTEXT實驗動物犬腺病毒檢測方法（征求意見稿）主要起草單位：中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所聯(lián)系人：韓凌霞聯(lián)系電話系信箱：hanlingxia@FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發(fā)布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實施FORMTEXT黑龍江省市場監(jiān)督管理局???發(fā)布DB23/XXXXX—XXXX前??言本標準依據(jù)GB/T1.1-2009的編寫規(guī)則起草。本標準由黑龍江省農業(yè)農村廳提出。本標準由黑龍江省實驗動物專業(yè)標準化技術委員會歸口。本標準起草單位：中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所。本標準主要起草人：韓凌霞、陳洪巖、張圓圓、趙麗麗、王玉娥、廉傳江、王偉。實驗動物犬腺病毒檢測方法范圍本標準規(guī)定了實驗動物犬腺病毒的術語和定義、原理、樣品處理和PCR檢測。本標準適用于犬腺病毒的PCR檢測。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T14926.58實驗動物傳染性犬肝炎病毒檢測方法GB19489實驗室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范NY/T683犬傳染性肝炎診斷技術SN/T4749犬傳染性肝炎檢疫技術規(guī)范術語和定義下列術語和定義適用于本文件。犬腺病毒I型（CAV-1）屬于腺病毒科，哺乳動物腺病毒屬，呈二十面體立體對稱，直徑為70nm～90nm，為無囊膜雙股DNA病毒，犬腺病毒I型（CAV-1）主要引起犬和其它犬科動物的犬傳染性肝炎。犬腺病毒II型（CAV-2）屬于腺病毒科，哺乳動物腺病毒屬，呈二十面體立體對稱，直徑為70nm～90nm，為無囊膜雙股DNA病毒，主要引起幼犬呼吸道疾病和腸炎，致病性較弱。原理CAV-1和CAV-2具有相同的免疫原性，實踐中多采用CAV-2作為疫苗免疫保護CAV-1感染。CAV-1的早期轉錄E3區(qū)比CAV-2缺失500bp，可用于鑒別檢測。樣品處理采樣前準備有關動物采集的實驗室風險按照GB19489的規(guī)定執(zhí)行。按照NY/T541的規(guī)定準備采樣工具和器械。拭子按照NY/T541的規(guī)定采集咽拭子。按照NY/T541的規(guī)定采集肛拭子按照NY/T541的規(guī)定采集鼻拭子。血清按照NY/T541的要求，在犬的前肢隱靜脈或頸靜脈采血。按照NY/T541的規(guī)定進行采血。按照NY/T541的規(guī)定制備并儲存血清。采樣后處理樣品采集結束后，所用到的銳器（如針頭）和產生的廢物處理按照GB19489的規(guī)定進行。PCR檢測引物P1：5'-CGCGCTGAACATTACTACCTTGTC-3'。P2：5'-CCTAGAGCACTTCGTGTCCGCTT-3'。基因組DNA提取按照SN/T4749制備犬樣品中的DNA?；蛘甙凑丈唐坊幕蚪MDNA提取試劑盒說明書，提取樣品中的基因組DNA。提取的DNA，質量和濃度檢測合格后，作為PCR檢測反應模板，立即進行檢測，或于-20℃低溫保存。PCR反應PCR反應體系：模板1μL，DNA聚合酶1μL，P1和P2（10μmol/L）各1μL，ddH2O7μL。反應條件為：95℃5min，94℃30s,62℃30s,72℃70s,35個循環(huán),72℃10min。設立陽性對照和陰性對照，陽性對照為CAV-1病毒培養(yǎng)液或陽性病料,陰性對照為無菌水。電泳反應結束后，取5μLPCR產物與上樣緩沖液混合，以醋酸鹽緩沖液為電泳緩沖液，于1%的瓊脂糖凝膠中電泳。同時以包含500bp和1000bp大小的適合的DNA分子質量標準物為參照。150V恒壓電泳25min，紫外燈下觀察。結果判定對照檢測結果應成立。被檢樣品僅在1030bp處出現(xiàn)條帶，判定被檢樣品中含有CAV-2核酸。被檢樣品同時在508bp和1030bp處各出現(xiàn)一條條帶