GB/T38132—2019轉(zhuǎn)基因植物品系定量檢測(cè)數(shù)字PCR法國家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)I1SN/T4853(所有部分)轉(zhuǎn)基因大米定量檢測(cè)數(shù)字PCR法2類別名稱序列玉米MON810品系特異序列外源下游引物FAM-AGATACCAAGCGGCCATGGACAACA品系特異序列外源TTCTCCATATTGACCATCAT下游引物CGGTATCTATAATACCGTGGFAM-ATCCCCGGAAATTATG玉米MIR162品系特異序列外源下游引物FAM-GTCCTCGTCGCTGCCCTTCA內(nèi)源下游引物VIC-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA大豆GTS-40-3-2品系特異序列外源下游引物FAM-ACAAAACTATTTGGGATCGGAGAAG大豆基因Lectin-1內(nèi)源下游引物VIC-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC水稻克螟稻品系特異序列外源TCCGCAATGTGTATTAAGT下游引物FAM-CGTCAATTTGTTTACACCACAATATATCCC3表1(續(xù))類別名稱序列水稻基因內(nèi)源下游引物VIC-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCTG棉花GHB119品系特異序列外源下游引物FAM-CCTGCAGGTCGACGGCCGAGTA棉花基因內(nèi)源下游引物FAM-TGCAGGTTTTGGTGCCACTGTGAAT油菜RT73品系特異序列外源下游引物FAM-TTCCCGGACATGAAGATCATCCTCCT油菜基因內(nèi)源下游引物FAM-CCGACCGTCACACCGATGTTTTAG按照GB/T19495.1和GB/T47.4DNA模板濃度控制采用PicoGreendsDNA熒光定量試劑盒或其他具有等效結(jié)果的核酸定量?jī)x或方法測(cè)定DNA溶液DNA的拷貝數(shù)濃度。濃度要求符合SN/T4853的規(guī)定。7.5.1數(shù)字PCR反應(yīng)體系水稻克螟稻品系采用雙重?cái)?shù)字PCR反應(yīng)體系見表2。轉(zhuǎn)基因棉花GHB119品系，轉(zhuǎn)基因油菜RT73品系采用單重?cái)?shù)字PCR反應(yīng)體系見表3。數(shù)字PCR反應(yīng)體系的總體積可根據(jù)不同廠家、型號(hào)的數(shù)字PCR儀做相應(yīng)調(diào)整，并保持各引物探針組分終濃度不變。每個(gè)DNA模板應(yīng)進(jìn)行3個(gè)平行數(shù)字PCR擴(kuò)終濃度內(nèi)源基因上游引物(10μmol/L)內(nèi)源基因下游引物(10μmol/L)外源基因下游引物(10μmol/L)DNA模板ddH?O(無菌水)—PCR反應(yīng)試劑2×數(shù)字PCR預(yù)混液ddH?O(無菌水)數(shù)字PCR反應(yīng)程序如表4和表5所示。5GB/T38132—2表4微滴數(shù)字PCR的反應(yīng)程序時(shí)間和溫度1退火延伸1表5芯片數(shù)字PCR反應(yīng)程序時(shí)間和溫度1退火延伸退火延伸1注：不同芯片平臺(tái)可根據(jù)說明書對(duì)除退火延伸外步驟中的溫度和時(shí)間做陽性對(duì)照，含相同內(nèi)源基因的非轉(zhuǎn)基因植物基因組DNA做陰性對(duì)照，以水作為空白對(duì)照。各對(duì)照8.1質(zhì)量控制擴(kuò)增平行重復(fù)測(cè)試結(jié)果(轉(zhuǎn)基因品系百分含量)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于或等于25%。8.2結(jié)果分析6A.1轉(zhuǎn)基因玉米MON810品系特異性序列GATGCCTTCTCCCTAGTGTTGACCAGTGTTACTCACATAGTCAATGCAGATGCCAAGCGGCCATGGACAACAACCCAAACATCAACGAGTGCATCCA.2轉(zhuǎn)基因玉米MON89034品系特異性序列TTCTCCATATTGACCATCATACTCATGCATCCCCGGTTATATATGTTTTTTTAAACCAA.3轉(zhuǎn)基因玉米MIR162品系特異性序列CACCTTCAGCAACCCGAACTACGCCAAGGTGAAGGGCAGCGACA.4轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2品系特異性序列AGCATCTACATATAGCTTCTCGTTGTTAGAAAAACAAAACTATTTGGGATCGGAGAAGAACTGTTTGAGGCGAATGGCCTGGTCTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTCTAAGCGTCAATTTGTTTACCCACAATATATCCA.6轉(zhuǎn)基因棉花GHB119品系特異性序列CCAGTACTAAAATCCAGATCATGCATGGACCTGCAGGTCGACGGCCGAGTAATTTTTAACA