關(guān)于血清蛋白電泳醋纖電泳圓盤電泳帶電粒子在電場中移動的現(xiàn)象稱為電泳。電泳技術(shù)即是利用樣品中各種帶電粒子的帶電性質(zhì)、分子大小、形狀等的差異，在電場中的遷移速度不同，從而對樣品分子進行分離、鑒定、純化和制備。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，該技術(shù)多用于分離，純化、鑒定蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)。

一、電泳技術(shù)第2頁,共31頁，星期六，2024年，5月電泳的分類

(1)按支持物的裝置形式不同分為：1．平板式電泳：支持物水平放置；2．垂直板式電泳：聚丙烯酰胺凝膠可做成垂直板式電泳；3．垂直柱式電泳：聚丙烯酰胺盤狀電泳第3頁,共31頁，星期六，2024年，5月掌握電泳法分離血清蛋白質(zhì)的原理掌握血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的操作方法及臨床意義二、實驗?zāi)康牡?頁,共31頁，星期六，2024年，5月本實驗是以醋酸纖維素薄膜作為支持體的區(qū)帶電泳。

方法是將少量新鮮血清用點樣器點在浸有緩沖液的乙酸纖維素薄膜上，薄膜兩端經(jīng)過濾紙與電泳槽中緩沖液相連，所用緩沖液pH值為8.6，血清蛋白質(zhì)在此緩沖液中均帶負電荷，在電場中向正極泳動。

三、實驗原理第5頁,共31頁，星期六，2024年，5月醋酸纖維素膜：該膜具有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu)，厚度約為120μm，有很強的通透性，對分子移動阻力很小。該薄膜電泳具有微量、快速、簡便、分辨力高，對樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點第6頁,共31頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)名稱等電點相對分子質(zhì)量清蛋白4.8869000α1-球蛋白5.06200000α2-球蛋白5.06300000β-球蛋白5.1290000~150000γ-球蛋白6.85~7.50156000~300000人血清蛋白質(zhì)的等電點及分子量第7頁,共31頁，星期六，2024年，5月經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳可將血清蛋白按電泳速度分為5條區(qū)帶，從正極端依次為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白，經(jīng)染色可計算出各蛋白質(zhì)的百分含量。γβα2α1清蛋白第8頁,共31頁，星期六，2024年，5月1.實驗材料：未溶血的人血清2.實驗試劑：巴比妥緩沖液氨基黑10B0.5％染色液漂洗液透明液3.實驗器材：醋酸纖維薄膜（2×8cm）常壓電泳儀鑷子點樣器玻棒粗濾紙培養(yǎng)皿吸量管直尺及鉛筆四、試劑及器材第9頁,共31頁，星期六，2024年，5月1.準備醋酸纖維素薄膜的預(yù)處理：將薄膜小心放入盛有緩沖液的培養(yǎng)皿內(nèi)，使其漂浮在液面；用鑷子輕壓，使其全部浸入緩沖液內(nèi)。待膜完全浸透（約半小時）后取出，夾在清潔的濾紙中間，輕輕吸去多余的緩沖液，同時分辨出光滑面和粗糙面。標記：在粗糙面上用鉛筆距薄膜條一端1.5cm處劃線即為點樣線并作好標記。五、試驗方法第10頁,共31頁，星期六，2024年，5月電泳槽的準備

電泳槽有兩個互相隔離的槽，各自裝有緩沖液，接不同的電極，紅色為正極，黑色為負極。每個槽上都有一根可移動的橫桿，紗布的一頭搭在橫桿上，另一頭浸入緩沖液中，形成了紗布橋。第11頁,共31頁，星期六，2024年，5月2.點樣（關(guān)鍵）

取出浸透的薄膜，平放在濾紙上(無光澤面向上)，用濾紙輕輕吸去多余的緩沖液，薄膜的粗糙面向上平放在點樣模版上，底邊對齊，點樣區(qū)距負極1.5cm。點樣時，用磨光的玻片蘸取血清后，均勻的涂抹在點樣區(qū)，使血清完全滲透至薄膜內(nèi)，形成一定寬度、粗細均勻的直線。（見圖）注意：點樣時動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果

。另外操作過程要防止指紋污染。第12頁,共31頁，星期六，2024年，5月3.電泳將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點樣面朝下），另一端平貼在陽極端支架上。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂，使膜平衡10min。連接好電泳儀。在室溫下電泳，打開電源開關(guān)，電壓160v，60min。點樣端1.濾紙橋2.電泳槽3.醋酸纖維素薄膜4.電泳槽膜支架5.電極室中央隔板

第13頁,共31頁，星期六，2024年，5月4.染色電泳完畢立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min。5.漂洗

用漂洗液漂洗，不停擺動薄膜條，每10min左右換一次液，連續(xù)更換數(shù)次，直至背景顏色脫去。將膜夾在干凈濾紙中，吸去多余溶液。操作中，注意控制染色和漂洗的時間，防止背景過深或某些區(qū)帶太淺。第14頁,共31頁，星期六，2024年，5月6.記錄和分析實驗結(jié)果

漂洗完畢后將薄膜取出,放在濾紙上。將薄膜上的5條色帶根據(jù)其顏色深淺、形狀、大小及相對位置進行描述、記錄在實驗本上，并判斷分析其結(jié)果。

第15頁,共31頁，星期六，2024年，5月血漿蛋白是血漿最主要的固體成分，含量60～80g/L

絕大部分由肝臟合成，僅γ球蛋白由漿細胞合成

正常值：白蛋白57％~72％，α1球蛋白2％~5％

α2球蛋白4％~9％，β球蛋白6.5％~12％

γ球蛋白12％—20％血漿蛋白的主要功能:維持血漿膠體滲透壓調(diào)節(jié)血漿pH值,維持酸堿平衡運輸營養(yǎng)物質(zhì),代謝物,激素,藥物及金屬離子等免疫作用七、臨床意義第16頁,共31頁，星期六，2024年，5月注意事項1、醋酸纖維素薄膜一定要充分浸透后才能點樣。點樣后電泳槽一定要密閉。電流不宜過大，以防止薄膜干燥，電泳圖譜出現(xiàn)條痕。

2、點樣時，動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。3、點樣應(yīng)點在薄膜的毛面上，點樣量要適量，不宜過多或過少。4、電泳時應(yīng)將薄膜的點樣端置于電泳槽的負極端，且點樣面向下。

5、通電過程中，不準取出或放入薄膜。通電完畢后，應(yīng)先斷開電源后再取薄膜，以免觸電。6、應(yīng)控制染色時間。時間長，薄膜底色不易脫去；時間太短，著色不易區(qū)分，或造成條帶染色不均勻，必要時可進行復(fù)染。

第17頁,共31頁，星期六，2024年，5月血清蛋白質(zhì)聚丙酰胺凝膠圓盤電泳第18頁,共31頁，星期六，2024年，5月1.學(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理

2.掌握聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳的操作技術(shù)一、實驗?zāi)康牡?9頁,共31頁，星期六，2024年，5月二、實驗原理聚丙烯酰胺凝膠：由丙烯酰胺（簡稱Acr）單體少量交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺通過化學(xué)催化劑（過硫酸銨），四甲基乙二胺（TEMED）作為加速劑或光催化聚合作用形成的三維空間的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。第20頁,共31頁，星期六，2024年，5月第21頁,共31頁，星期六，2024年，5月三、實驗器材與試劑1.實驗材料：正常人血清2.實驗器材：圓盤電泳槽、電泳儀、玻璃管（10cm×0.6cm）、洗耳球、培養(yǎng)皿、微量加樣器、注射器、小燒杯第22頁,共31頁，星期六，2024年，5月試劑號配方PH1單體交聯(lián)劑丙烯酰胺（Acr）30g甲叉丙烯酰胺（Bis）0.8g加蒸餾水到100ml2過硫酸銨1g+10ml蒸餾水3四甲基乙二胺（TEMED）4電泳緩沖液硼砂30.512g硼酸4.948g蒸餾水定容至1000ml工作液：90ml貯儲液+1440ml水9.05固定液三氯乙酸12.5g蒸餾水定容至1000ml6染色液CBBG-2500.1g溶于95%乙醇后，加蒸餾水到100ml3.實驗試劑第23頁,共31頁，星期六，2024年，5月7分離膠緩沖液Tris6.06gEDTA1.17g定容至100ml8.88上樣緩沖液電泳緩沖液25ml蔗糖10g

0.05％溴酚藍5ml加蒸餾水至100ml9洗脫液、保存液冰乙酸38ml甲醇125ml蒸餾水338ml第24頁,共31頁，星期六，2024年，5月四、實驗方法1.凝膠柱的準備（1）取一只10cm×0.6cm潔凈﹑干燥的玻璃管，在7cm和8cm兩處做一個記號，一端用封口膜嚴實，垂直放好。（2）.按下表配制分離膠溶液試劑分離膠（ml）分離膠緩沖液單體交聯(lián)劑雙蒸水10％過硫酸銨TEMED12.16.80.10.01把分離膠溶液混勻后，用自動取液器吸取上述配好的分離凝膠貯液沿著小玻管內(nèi)壁小心準確加入7cm高。第25頁,共31頁，星期六，2024年，5月（3）凝膠溶液加畢后，隨即吸取蒸餾水，加至管中的凝膠表面，使其表面覆蓋一水層（水封，1.0cm高）。在灌膠和封水的過程中，操作要輕，以避免產(chǎn)生氣泡。（4）將加注好的凝膠管于室溫下靜置，以進行聚合反應(yīng)，在正常情況下大約30-60分鐘后，待界面出現(xiàn)明顯分層現(xiàn)象時，表明膠已聚合完畢，先用習(xí)慣吸去上面的水層，在用濾紙將殘留的水分吸干。2.樣品液制備取正常人血清0.1ml，與1.9ml的上樣緩沖液混合3.裝柱

將凝膠管插入電泳槽槽底橡膠塞孔中，加入電極緩沖液與下電泳槽，隨后放入凝膠管及上槽，除氣泡(上電極槽以電極和凝膠管完全浸入為宜，下電極槽以凝膠管浸入3/5為宜)。用微量注射器吸去混合后的樣品液30μl加到分離膠面上（加樣槍不可插入過深，以免刺破凝膠，同時要緩慢、均勻，以免攪動緩沖液引起樣品擴散），最后加入電泳緩沖液。第26頁,共31頁，星期六，2024年，5月4.電泳接通電源，上負下正，調(diào)節(jié)電流3mA/管，電壓260V-280V，待示蹤染料離管下口0.5cm時切斷電源。第27頁,共31頁，星期六，2024年，5月5.剝膠注入蒸餾水做潤滑劑，針頭螺旋式前進，緩緩剝離，最后用洗耳球在管的一端輕輕擠壓，另一端對著一干凈大小適宜的培養(yǎng)皿內(nèi)，此時可以將凝膠柱壓出玻管。第28頁,共31頁，星期六，2024年，5月6.固定和染色用固定液浸泡凝膠條，此過程用來固定蛋白質(zhì)，10min后倒去固定液，再加入染色液，在90℃水浴染色15min，倒去染色液。7.脫色將染色完畢的膠條用脫色液浸泡，中間更換1~2次脫色液并浸泡過夜，將浮色脫去進行觀察染好色的蛋白帶第29頁,共31頁，星期六，2024年，5月丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是神經(jīng)毒性試劑，可經(jīng)皮膚、呼吸道等吸收，對皮膚有刺激作用，注意避免直接接觸，故操作時要注意保護沒有聚