第十四單元基因工程

第46講重組DNA技術的基本工具

【學習目標】

1.概述基因工程是在遺傳學、微生物學、生物化學和分子生物學等學科基礎上發(fā)展而來

的。

2.闡明DNA重組技術的實現(xiàn)需要利用限制性內切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基

本工具。

3.DNA的提取和鑒定。

【模型構建】

【自主學習】

-基礎理論和技術的發(fā)展催生了基因工程

1.基因工程概念

(1)操作環(huán)境：生物體外。

(2)操作水平：DNA分子水平.

(3)主要技術：體外DNA重組和轉基因等技術。

(4)操作結果：賦予生物新的遺傳特姓，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產

品。

(5)育種原理：基因重組。

2.基因工程的誕生和發(fā)展(摘要)

(1)1953年，沃森和克里克建立了DNA雙螺旋結構模型并提出了遺傳物質自我復制的假

說。

(2)1970年，在細菌體內發(fā)現(xiàn)了第一個限制性內切核酸醐(簡稱限制酶),后來又發(fā)現(xiàn)了多

種限制酶、DNA連接酶等。

(3)1972年，伯格首先在體外進行DNA改造，并成功地構建了第一個體外重組DNA分

子。

(4)1983年，科學家采用農桿菌轉化法培育了世界上第一例轉基因煙草。

(5)1984年，我國科學家朱作言領導的團隊培育了世界上第一條轉基因魚。

(6)基因工程是在生物化學、分子生物學和微生物學等學科的基礎上發(fā)展起來的。

二基因工程的基本工具

1.限制性內切核酸酶(也稱“限制酶”)——“分子手術刀”

(1)來源：主要來自原核牛.物。

(2)特點：具有專一性。

(3)功能：識別雙卷DNA分子的特定核昔酸序列,并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二

酯鍵斷開。

(4)作用結果：當限制酶在它識別序列的中心軸線兩側將DNA分子的兩條鏈分別切開時，

產生的是黏性末端:當限制酶在它識別序列的中心軸線處切開時，產生的是平末端。

2.DNA連接酶——“分子縫合針”

(1)種類

種類

比較項目

E.coliDNA連接酶T4DNA連接前

來源大腸桿菌T4噬菌體

既可以“縫合”雙鏈DNA片段

只能“縫合”具有互補黏性末

特點互補的黏性末端,又可以“縫

躺的雙鏈DNA片段

合”雙鏈DNA片段的平末端

(2)功能：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢一被限制酶切開的磷酸二片鍵。

3.基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”

(1)種類：通常用質粒作為載體,另外還有噬菌體和動植物病毒等。

(2)作用

①將外源基因送入受體細胞。

②在受體細胞內對目的基因進行大量復制。

(3)必備條件

①質粒DNA分子上有一個至多個限制酶切割位點,供外源DNA片段(基因)插入其中。

②能在細在中講行自我復制,或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復制。

③在基因工程操作中，真正被用作載體的質粒，都是在天然質粒的基礎上經過人工改造

的，這些質粒上常有特殊的標記基因,其作用是便于重組DNA分子的篩選。

④對受體細胞無害。

三DNA的粗提取與鑒定

1.實驗原理

(1)提取思路：DNA、RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面存在差異，可以利用

這些差異，選用適當?shù)奈锢砘蚧瘜W方法對它們進行提取。

(2)DNA的性質：利用DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精，可初步分離DNA與

蛋白質；DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于ZjHOl/L的NaCl溶液。

(3)DNA的鑒定：在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍色,因此二苯胺試劑可以

作為鑒定DNA的試劑。

2.材料選擇

富含DNA的材料，如新鮮洋蔥(也可以選擇香蕉、菠菜、菜花或豬肝等)。

注意：不選擇哺乳動物的血液為材料來提取DNA,因為哺乳動物成熟的紅細胞中沒有細

胞核和線粒體等，DNA含量太少。

3-方法步驟

(1)研磨：取30g洋蔥，切碎，放入研缽中，倒入10mL研磨液,充分研磨。

(2)除雜：漏斗中墊上紗布過濾后，在4℃冰箱中靜置后取上清液,1500r/min的轉速下

離心5min,取上清液。

(3)提?。杭尤塍w積相等的、預冷的酒精溶液(體積分數(shù)為95%),溶液出現(xiàn)的白色絲狀物

是DNA。

方法一：用玻璃棒沿一個方向攪拌,卷起絲狀物，用濾紙吸去上面的水分。

方法二：10000r/min的轉速下離心5min,取沉淀物晾干。

(4)鑒定DNA

試管編號A管(對照組)B管(實驗組)

步驟1加入2mol/L的NaCl溶液5mL

步驟2不進行任何處理加絲狀物或沉淀物

步驟3加4mL二苯胺試劑,混勻

步驟4沸水浴5min

實驗現(xiàn)象溶液不變藍色溶液逐漸變?yōu)樗{色

實驗結論DNA在沸水浴的情況下遇二苯胺會被染成藍色

【合作探究】

基因工程的工具酶

EcoRI限制酶和I限制酶的作用示意圖。請據圖回答:

切點

5L

GXG-AATTC

IIII±TTAAG

3-CTAG

中軸線切點黏性末端

圖1

5iCCC手GG3'G

IIIIII

GGGCCCII

3'-:c5'

中軸線(切點)平末端

圖2

(1)請說出EcoRI限制酶和SmaI限制酶識別的堿基序列及切割的位點。

提示：EcoRI限制酶識別的堿基序列是一GAATTC—，切割位點在G和A之間；SmaI

限制酶識別的堿基序列是一CCCGGG—，切割位點在C和G之間。

(2)￡coRI限制酶和SmaI限制酶作用的結果分別是什么？

提示：EcoRI限制酶切割DNA分子，產生黏性末端，SmaI限制酶切割DNA分子，產

生平末端。

(3)以上實例說明限制酶有何特性？該特性的含義是什么？

提示：說明限制酶具有專一性。專一性指的是限制酶能識別特定的核甘酸序列，并在特

定的切割位點上進行切割。

2.DNA連接酶、限制酶和DNA聚合酶都作用于哪種化學鍵，分別對化學鍵有何影響？

提示：均作用于磷酸二酯鍵，DNA連接酶和DNA聚合酶是形成磷酸二酯鍵，限制酶是

破壞磷酸二酯鍵。

基因工程中的載體

分析質粒載體結構模式圖，回答下列問題:

擬核吧大腸桿菌細胞

目的基因

插入位點

'氨節(jié)青霉素

抗性基因

國制原點」

質粒

大腸桿菌及質粒結構模式圖

(1)質粒上氨半青霉素抗性基因的作用是什么？

提示：作為標記基因，便于重組DNA分子的篩選。

(2)為使外源基因插入質粒中，質粒需具備的條件是什么？

提示：有一個至多個限制性內切核酸酶的切割位點。

三.DNA的粗提取與鑒定

1.鳥類和哺乳動物的紅細胞都適合用來提取DNA嗎？請說明理由。

提示：哺乳動物的成熟紅細胞沒有細胞核，不適合作為提取DNA的材料。

2.實驗過程要充分地攪拌和研磨，如果研磨不充分，會對實驗結果產生怎樣的影響？

提示：研磨不充分會使細胞核內的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，導致看不到

絲狀沉淀物，用二苯胺鑒定時顏色反應不明顯。

3.實驗過程中應如何使用玻璃棒攪拌？為什么？

提示：攪拌時玻璃棒不能直插燒杯底部，攪拌要輕緩，并向一個方向攪拌以便獲得較完

整的DNA分子。

【深化拓展】

基因工程的工具酶

1.限制酶

(1)限制酶的作用

限制酶具有特殊的識別和切割功能，在基因工程中，一方面被用于切割含目的基因的

DNA分子，以獲取目的基因；另一方面用于切割載體。

(2)識別序列的特點

呈現(xiàn)堿基互補對稱，無論是奇數(shù)個堿基，還是偶數(shù)個堿基，都可以找到一條中心軸線，

中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向對稱重復排列的。

CCClGGGRRAGFIA

如GGGICCC以中心線為軸，兩側堿基互補對稱；以;為軸，兩側堿基互補對

GGTCCT

(3)限制酶切割方式

①上下交錯切割：限制酶在DNA雙鏈的不同位置切割DNA(即在識別序列的中軸線兩側

切割)，產生的DNA片段的末端兩條鏈一長一短，不是平齊的，即黏性末端，如圖：

片段分離

黏性末端

②上下對稱切害！1：限制能在DNA雙鏈的相同位置切割DNA(即沿著識別序列的中軸線切

割)，這樣產生的末端兩條鏈平齊，即平末端，如圖：

片段分離

三翻’+福F

平末端

2.DNA連接酶

(1)作用

將具有相同或互補黏性末端以及具有平末端的DNA片段“縫合”成新的DNA分子。

(2)連接方式

DNA連接酶可把黏性末端和平末端之間的縫隙“縫合”起來，相當于把梯子兩邊的扶手

的斷口連接起來，形成兩個磷酸二酯鍵。DNA連接酶與堿基之間氫鍵的形成無關。

IATTClI--

I'-I■-J-4?-卜?I

CTTAA：G

3.DNA連接酶與DNA聚合酶的比較

項目DNA連接酶DNA聚合酶

相同點催化兩個脫氧核甘酸之間形成磷酸二酯鍵

模板不需要模板需要DNA的一條鏈為模板

不

作用對象游離的DNA片段單個的脫氧核甘酸

同

作用結果形成完整的DNA分子形成DNA的一條鏈

點

用途基因工程DNA復制

(1)切割不同的DNA片段但產生相同的黏性末端的一類限制性內切核酸酶稱為同尾酶。

這類酶的特點：①識別的序列不同，但可以切割產生相同的黏性末端，且切割產生的黏性末

端可以相互配對；②兩個同尾酶切割的DNA片段連接后，一般情況下，不能再被原來的限

制酶識別。如氏/mHI和8g/II就是常見的同尾酶。

限制酶識別序列和切割位點產物

1

5'-GGATCC-3'GATCC-

BamU1

3'-CCTAGG—5'-CCTAGG-

f

1

5,-AGATCT-3,-AGATCT-

Bg/n11

3'-TCTAGA-5'-TCTAGA-

f

(2)限制酶識別的堿基序列的中軸線兩側的堿基互補對稱，如BawHl的識別序列

-GGAiTCC-

-CCTJAGG-,中軸線(虛線)兩側的堿基互補對稱。

(1)對于鏈狀DNA分子而言，如果用限制酶切割后形成2個DNA片段，則其上有1個限

制酶切割位點；如果用限制酶完全切割后形成3個DNA片段，則其上有2個限制酶切割位

點，以此類推。

(2)對于環(huán)狀DNA分子而言，如果用限制酶切割后形成1條鏈狀DNA分子，則其上有1

個限制酶切割位點；如果用限制酶完全切割后形成2個DNA片段，則其上有2個限制酶切

割位點，以此類推。

基因工程的載體

1.載體上標記基因的標記原理

載體上的標記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉入的受體細胞沒有抵抗

相關抗生素的能力。當含有抗生素抗性基因的載體進入受體細胞后，抗性基因在受體細胞內

表達，使受體細胞能夠抵抗相應抗生素，所以在受體細胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可

以只保留轉入載體的受體細胞，原理如圖所示:

在含有氨芳青霉素

的培養(yǎng)基上培養(yǎng)'

只有含有載體

并且載體上的

霉素抗性基有的大腸桿菌中

標記基因表達

因的質粒有載體進入，有的

沒有載體進入的大腸桿菌才

能存活并增殖

2.作為載體所具備的條件

條件分析

穩(wěn)定并能復制目的基因穩(wěn)定存在且數(shù)量可擴大

有一個至多個限制酶

可攜帶多個或多種外源基因

切割位點

具有特殊的標記基因便于重組DNA的鑒定和選擇

無毒害作用避免受體細胞受到損傷

3.基因工程中的載體與細胞膜上的載體蛋白的區(qū)別

基因工程中的載體細胞膜上的載體蛋白

本質細菌的質粒、噬菌體、動植物病毒等細胞膜上的蛋白質

攜帶外源基因進入受體細胞中，并在受體細胞中

運載要進出細胞的特

作用進行自我復制，或整合到染色體DNA上，隨染

定物質

色體DNA進行同步復制

（1）基因工程中常用的載體有質粒、動植物病毒、噬菌體等。

（2）質粒與載體的關系：一方面，質粒是基因工程中常用的載體，但載體并不都是質粒；

另一方面，天然質粒并不完全符合作為載體的條件（如沒有合適的標記基因等），往往需要人

工改造。

三.DNA的粗提取與鑒定

1.粗提取DNA的方法步驟

、4七冰

等

體

身箱靜置機

|靜置2~3min,

尸幾分鐘體

積

30g10mL紗布,分用玻璃棒卷

洋蔥研磨液w~為％起絲狀物，并

冷95

酒

（含核精用濾紙吸去

物質）水分

配取上清液

器

一.

塑

離心考1500r/min[料10000r/min離心

次離心5min離5min,棄上清液,

管心將沉淀物（粗提

管取的DNA）晾干

|研磨洋蔥|------取上清液||析出DNA|

2.DNA粗提取的注意事項

(1)加入研磨液后，必須充分研磨，否則細胞核不會充分破碎，釋放出的DNA量就會減

少。

(2)粗提取的DNA中可能含有少量的蛋白質等。

(3)析出DNA時必須用“冷酒精”。預冷的酒精具有以下優(yōu)點：

①可抑制核酸水解酶的活性，進而抑制DNA降解。

②抑制分子運動，使DNA易形成沉淀析出。

③低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂。

(4)實驗中出現(xiàn)的絲狀物的主要成分是DNA,實際上每一根“絲”都是由許多DNA分子

聚集在一起形成的，應用玻璃棒沿一個方向緩慢攪拌，避免破壞DNA。

(5)為減少DNA的損失，實驗過程中一般使用紗布過濾。

3.歸納法分析各步驟的原理或目的

步驟原理或目的

充分研磨使細胞破碎，DNA溶解于研磨液中

除去細胞膜等不溶雜質，得到與蛋白質等雜質結合在一起的溶解于濾液

過濾(或離心)

(或上清液)的DNA

攪拌(或離心)析出加入預冷的酒精溶液，蛋白質溶于酒精，DNA不溶于酒精，將DNA和

DNA蛋白質等雜質分離

溶解用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA

鑒定DNA二苯胺試劑現(xiàn)配現(xiàn)用，水浴加熱，溶液變藍色則證明有DNA存在

第47講基因工程的基本操作程序

［學習目標］

1.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的獲取、基因表達載體的構建、目的

基因導入受體細胞和目的基因及其表達產物的檢測與鑒定等步驟。

2.利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增DNA片段并完成電泳鑒定，或運用軟件進行虛擬PCR

實驗。

【模型建構】

“篩選合適的目福回

目的基因的

PCR技術擴增目的基因卜

組成:啟動子、目的基因、

基因表達載終止子、標記基因等

NA段

DN片

體的構建

擴

構建：限制酶切割、DNA的

基因工

及

連接酶連接增

程的基

泳

本操作植物細胞:花粉管通道電

定

鑒

程序將目的基法、農桿菌轉化法等

一因導入受一動物細胞：顯微注射法|

體細胞

原核生物細胞：Ca2+處理法等

分子水平的檢測卜——:

目的基因的

檢測與鑒定個體生物學水平的鑒定|

【自主學習】

-目的基因的篩選與獲取

1.目的基因

(1)在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因就

是目的基因。

(2)主要是指編碼蛋白質的基因。

2.篩選合適的目的基因

(1)從相關的已知結構和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。

(2)隨著測序技術的發(fā)展，以及序列數(shù)據庫、序列比對工具等的應用，越來越多的基因的

結構和功能為人們所知，這也為科學家找到合適的目的基因提供了更多的機會和可能。

3-利用PCR獲取和擴增目的基因

(l)PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫。

(2)原理：DNA半保留復制o

(3)DNA復制所需的基本條件

參與的組分在DNA復制中的作用

解旋酶(體外用高溫代替)打開DNA雙鏈

DNA母鏈提供DNA復制的模板

4種脫氧核甘酸合成DNA子鏈的原料

DNA聚合酶催化合成DNA子鏈

引物使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核昔酸

(4)PCR反應條件：一定的緩沖溶液、DNA模板、分別與兩條模板鏈結合的引物、4

種脫氧核甘酸和耐高溫的DNA聚合酶；同時通過控制溫度使DNA復制在體外反復進行。

(5)擴增的過程

基于PCR的過程，回答下列問題：

3一“3,

,UUUUUUUUUUUMI1J

3，,nnnnnnnnnnnrmr[5,

待擴增的DNA片段

LIUUULIUIJL1UULI哪

A.nnnnnnnnnnnn

過程1為變性,該階段的溫度為90一。C以上,目的是使雙鏈DNA解聚為單鏈。

過程11為復性，該階段的溫度為皎工左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA

結合。

過程III為延伸,該階段的溫度為22工左右，該過程需要在Q］耐高溫的DNA聚合酶的

作用下，利用4種脫氧核甘酸為原料，根據堿基互補配對原則從子鏈的3二端延伸合成新的

子鏈DNA。

(6)PCR產物的鑒定：常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。

二基因表達載體的構建

1.目的

(1)使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。

(2)使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。

2.組成

終止子

(終止轉錄)

標記基因

(鑒別和篩選

目的基因)

(1)啟動子是一段有特殊序列結構的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶識別和

結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA。

(2)終止子也是一段有特殊序列結構的DNA片段，位于基因的工相當于一盞紅色信

號燈，使轉錄在所需要的地方停下來。

3.基因表達載體的構建過程

(1)用一定的限制酸切割載體，使它出現(xiàn)一個切口。

(2)用同種限制酶或能產生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。

(3)利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處,這樣就形成了一個重組DNA

分子。

三將目的基因導入受體細胞

1.我國科學家獨創(chuàng)的方法：花粉管通道法。

2.花粉管通道法的操作方式有多種，例如：

(1)用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。

(2)在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將夜滴加在花柱切面上，使目的基

因借助花粉管通道進入胚囊。

3.將目的基因導入植物細胞常用的方法還有五枉菌轉化法。

四目的基因的檢測與鑒定

1.首先是分子水平的檢測

檢測目的檢測方法

受體細胞的染色體DNA上是否插入了目的基因

PCR等技術

目的基因是否轉錄出了mRNA

目的基因是否翻譯成相應蛋白質抗原一抗體雜交

2.其次，還需要講行個體牛.物學水平的鑒定。

3.目的基因還可以通過構建基因文庫來獲取。

4.將目的基因導入動物受精卵最常用的方法是顯微注射法。

5.將目的基因導入大腸桿菌時，研究人員一般先用胃處理大腸桿菌細胞，使細胞處

于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，然后再將重組的基因我達載體導入其中。

【合作探究】

目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建

類型體內DNA復制PCR

細胞有絲分裂前的______和減

時期人工控制，隨時進行

數(shù)分裂前的________

場所細胞內細胞外

是否需要ATP需要不需要

在_______作用下，細胞提供能90℃以上________,DNA雙鏈

解旋

量，________雙鏈解開________，不需要解旋酶

解旋酶、DNA聚合酶、DNA連

酶—

接酶等

一條鏈不連續(xù)合成，再由DNA分別從兩條引物的__________________,

合成子鏈

連接酶連接都是連續(xù)合成

3，

3，||||-----5'

5,山T5，

過程S，_“II

3，

__________________（有岡崎片段）

循環(huán)次數(shù)受生物體自身控制一般要經歷30次

產物完整DNA兩種引物之間的_________

①都需要提供DNA模板；②都需要在一定環(huán)境中進行；③DNA合成方

相同點

向都是從子鏈的5'端向3'端延伸

提示：間期間期解旋酶部分DNA高溫解聚全部解開耐高溫的DNA聚合酶

3'端開始延伸邊解旋，邊復制變性、復性、延伸DNA片段

2.啟動子和起始密碼子有什么區(qū)別？終止子和終止密碼子有什么區(qū)別？

提示：啟動子和終止子都是一段有特殊結構的DNA序列，分別位于基因的首端和尾端，

分別負責調控基因轉錄的開始和結束。而起始密碼子和終止密碼子都是mRNA上的三個相連

的堿基序列，分別決定翻譯的起始和終止。

二.將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定

1.為什么在用農桿菌轉化法將目的基因導入植物細胞的過程中，一定要將目的基因插入Ti質

粒的T-DNA上？

提示：Ti質粒上的T-DNA也稱為可轉移DNA,可轉移至受體細胞，并且整合到受體細

胞的染色體DNA上。

2.如圖為抗蟲棉的接種實驗，結合圖示（左圖為抗蟲轉基因棉使蟲體發(fā)育不正常）探究以

下問題：

抗蟲棉的接種實驗（左為抗蟲轉基因棉）

（1）判斷抗蟲棉的接種實驗屬于鑒定。

（2）檢測方法是,觀察指標是.

提示：（1）個體生物學水平（2）讓害蟲吞食棉葉害蟲的存活情況

【深化拓展】

目的基因的篩選與獲取、基因表達載體的構建

1.PCR技術

(l)PCR中的環(huán)節(jié)

環(huán)節(jié)溫度控制目的

預變性90℃以上增加大分子模板DNA徹底變性的概率

變性90?95℃使雙鏈DNA解聚為單鏈

I55-60℃兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合

循

復性

環(huán)在DNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成

170?75℃

新的DNA鏈

延伸

(2)PCR反應過程圖解

①第一次循環(huán)示意圖

IliumIIIII^

變性七3,

3T~I~?~n~?~?~?????55???—p-]~~?~~??????

復性|55X,

3,.......................s/轆S，

IIIIIII........5..,,||||||^

引物I

,延伸172t引物口，

5-1IIIIIIIIIlliy1111111111113(

引物I'J

②PCR擴增的結果示意圖(如圖)

引物n

3'-5'

口

I11IIIIIIy

引物I

③PCR擴增的計算：理論上DNA呈指數(shù)擴增。

a.若開始只有一個DNA提供模板，則循環(huán)〃次后獲得的子代DNA數(shù)目為2"個。

b.若開始有No個DNA提供模板，則循環(huán)“次后獲得的子代DNA數(shù)目為M2"個。

(l)PCR反應過程的兩點提醒

①復性不一定均為引物與DNA模板結合。復性時，引物與DNA模板的結合是隨機的，

也存在DNA解開的兩條鏈的結合。

②PCR反應的結果不都是所需的DNA片段。因為第一次循環(huán)得到的DNA片段只有一種

引物，比所需的DNA片段要長，從第二次循環(huán)才出現(xiàn)所需的DNA片段，這樣的片段存在兩

種引物。

(2)PCR中與引物有關的5個易錯點

①設計引物的依據通常是目的基因兩端的核昔酸序列。

②用于PCR的引物長度通常為20?30個核甘酸。若引物長度過短，則引物與模板鏈結

合的特異性較差。

③兩種引物需符合以下要求，否則引物失效，得不到擴增產物:

a.每種引物內部不能發(fā)生局部堿基互補配對，否則會導致自身折疊；

b.兩種引物之間不能在局部發(fā)生堿基互補配對，否則會導致引物自連。

④為了便于擴增的DNA片段與表達載體連接，需在引物的5'端加上限制酶的酶切位

點，且常在兩種引物上設計加入不同的酶切位點，主要目的是保證目的基因與載體的正向連

接。

⑤復性溫度與設計的引物(長度、堿基組成)有關：

a.長度相同但G—C含量高的引物需要設定的復性溫度較高；

b.若復性溫度過高，則會破壞引物與模板的結合，可能導致PCR反應得不到任何擴增

產物。

方法技巧

解答利用PCR獲取和擴增目的基因類試題的兩個關鍵點

解答利用PCR獲取和擴增目的基因類試題時首先要明確PCR所需的條件、過程，其次

要掌握PCR與體內DNA復制的異同。

(1)關鍵點一：圖解法巧記PCR過程中的溫度變化

①高溫②低溫③適溫

重復①?③步

變性復性延伸

?25-30次

溫-目的DNA片段

度擴增100萬倍以上

(七)子鏈延伸、

vz\____/DNA加倍

含食DNA單鏈

I案與引物結合

-DNA雙螺旋

時間(min)

(2)關鍵點二：PCR與體內DNA復制在場所、解旋方式、酶的種類、溫度調節(jié)、產物等

方面均存在不同，需要牢固掌握才能準確答題。

2.基因表達載體構建時有關限制酶的選擇

選擇限制酶時要考慮目的基因兩端的限制酶切割位點、質粒上的限制酶切割位點及是否

破壞目的基因和標記基因來確定限制酶的種類。

PstISmaIPstI

口標記基因

乙

(1)根據目的基因兩端的限制酶切割位點確定限制酶的種類

①應選擇酶切位點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇Ps/I。

②不能選擇酶切位點位于目的基因內部的限制酶，如圖甲不能選擇Snal。

③為避免目的基因和質粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因

和質粒，如圖甲也可選擇用PstI和EcoRI兩種限制酶(但要確保質粒上也有這兩種酶的酶切

位點)。

(2)根據質粒的特點確定限制酶的種類

①所選限制酶與切割目的基因的限制酶一般相同，以確保具有相同的黏性末端。

②質粒作為載體必須具備標記基因等，所以所選擇的限制前應不能切割質粒上的所有標

記基因，即至少要保留一個標記基因，用于重組DNA的鑒定和選擇。如圖乙中質粒不能使

用限制酶SnaI切割，因為會破壞標記基因.

基因表達載體易錯點剖析

(1)基因工程中的基因表達載體￥載體：基因表達載體與載體相比增加了目的基因。

(2)目的基因插入位點不是隨意的：基因表達載體需要啟動子與終止子的調控，所以目的

基因應插入啟動子和終止子之間的部位，若目的基因插入啟動子部位，啟動子將失去原功能。

將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定

1.將目的基因導入植物細胞

方法實例操作方式

①可以用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房

花粉管將基因導入

中；②可以在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶

通道法棉花細胞

液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊

將擬南芥花序①可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農桿菌共培養(yǎng)，然

農桿菌浸沒在含有農后篩選轉化細胞，并再生成植株；②可以將花序直接浸沒在含

轉化法桿菌的溶液中有農桿菌的溶液中一段時間，然后培養(yǎng)植株并獲得種子，再進

進行轉化行篩選、鑒定等

!：易錯警示--

(D轉化是指目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程。

(2)此處的“轉化”與肺炎鏈球菌轉化實驗中的“轉化”含義相同，實質都是基因重組。

2.將目的基因導入其他受體細胞的方法

受體細胞類型常用方法過程

將含有目的基因的表達載體提純一取受精

卵一顯微注射一注射了目的基因的受精

動物細胞顯微注射法

卵，經胚胎早期培養(yǎng)一胚胎移植一獲得具

有新性狀的動物

原核生物細胞先用Ca2+處理大腸桿菌細胞(增加細胞壁

Ca2+處理法

(大腸桿菌應用通透性)~細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境

最廣泛）中DNA分子的生理狀態(tài)一將重組的基因

表達載體導入該細胞中

：3方法技巧

農桿菌轉化法中的兩次拼接和兩次導入

第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T-DNA上，第二次拼接（非人工操作）是指插

入目的基因的T-DNA被拼接到受體細胞的染色體DNA上；第一次導入是將含目的基因的

Ti質粒導入農桿菌，第二次導入（非人工操作）是指含目的基因的T