釀酒酵母的紫外誘變選育及發(fā)酵條件研究摘要：以果園土為菌種來(lái)源，采用平板分離法得到５種酵母菌，對(duì)其進(jìn)行紫外線誘變，篩選出７株酵母菌突變株，通過(guò)測(cè)定突變株的發(fā)酵性能，從中篩選出１株液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力及發(fā)酵力均較好的酵母突變株Ｎ４－４，其發(fā)酵液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力和發(fā)酵力比對(duì)照菌株分別提高了６．７％、７．５％、８．１％和３９．０％，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)確定該突變株的最佳發(fā)酵條件。結(jié)果表明，在３０℃、１２０ｒ／ｍｉｎ的培養(yǎng)條件下，突變株最佳發(fā)酵條件為３％葡萄糖、３％（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ５．０、３％接種量（Ｖ∶Ｖ）。

關(guān)鍵詞 ：酵母菌；紫外線誘變；發(fā)酵條件

中圖分類(lèi)號(hào)：TS261.1；Q93.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439－８114（２０15）07－1664-04

DOI:10.14088/jki.issn0439-8114.2024.07.034

酵母菌是白酒發(fā)酵過(guò)程中的一種重要微生物，白酒風(fēng)味的形成與發(fā)酵過(guò)程中各種酵母菌息息相關(guān)［１］。酵母菌的主要作用是將原料糖化后的絕大部分糖類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇和二氧化碳，同時(shí)生成甘油、高級(jí)醇、酯、醛等代謝產(chǎn)物，直接影響著白酒的色澤、香氣及口感，決定著白酒的質(zhì)量。酵母菌的發(fā)酵特性常常因菌株的不同而存在明顯的差異［２］，野生型酵母菌在工業(yè)發(fā)酵過(guò)程中不可避免地受到脅迫條件（如乙醇毒性、高溫脅迫等）的影響，最終影響到乙醇產(chǎn)率和白酒品質(zhì)以及其經(jīng)濟(jì)效益。工業(yè)上常常采用紫外線誘變的方法，對(duì)釀酒酵母工業(yè)菌株進(jìn)行改良來(lái)提高菌株對(duì)脅迫條件的耐受性［３］。本試驗(yàn)采用紫外線誘變的方法對(duì)果園土中分離到的５株酵母菌進(jìn)行誘變，以期篩選出發(fā)酵力較高的突變株，為提高白酒的產(chǎn)量和質(zhì)量提供參考。

１材料與方法

１．１材料

菌種來(lái)源：分離自陜西省周至縣邵家堡村蘋(píng)果園土壤中。

１．２試驗(yàn)方法

１．２．１酵母菌分離、純化和菌種保藏酵母菌的分離、純化和菌種保藏

參考文獻(xiàn)［４－６］。

１．２．２不同菌株發(fā)酵性能測(cè)定將分離得到的菌株分別制成酒曲后用常壓干燥法測(cè)定水分含量；采用酸堿滴定法測(cè)定酸度；采用碘量法測(cè)定液化酶活力；采用ＤＮＳ法測(cè)定糖化酶活力；采用福林－酚法測(cè)定蛋白酶活力；采用ＣＯ２失重法測(cè)定發(fā)酵力［７，８］。

１．２．３紫外線（ＵＶ）誘變選取發(fā)酵性能最好的菌種接種至裝有麥芽汁液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，１３０ｒ／ｍｉｎ振蕩培養(yǎng)，于２８℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)４８ｈ，得到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段的釀酒酵母菌懸液［９］。再用麥芽汁液體培養(yǎng)基將菌懸液稀釋?zhuān)咕N的濃度達(dá)到１×１０６個(gè)／ｍＬ。打開(kāi)紫外燈（１５Ｗ），預(yù)照射２０ｍｉｎ，使其功率達(dá)到穩(wěn)定。取４ｍＬ菌懸液放入直徑為９ｃｍ的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿平放在距紫外燈３０ｃｍ（垂直距離）處的磁力攪拌器上，啟動(dòng)磁力攪拌器，照射０、１、２、３、４、５、6ｍｉｎ后將菌液在黑暗中冷凍保存１～２ｈ，然后在紅燈下稀釋至１×１０－６個(gè)／ｍＬ，并涂布平板，２８℃恒溫培養(yǎng)４８ｈ，計(jì)算菌株致死率，保存致死率在７５％以上的孤立菌落［１０］。

１．２．４優(yōu)良突變株的篩選在“1.2.3”的基礎(chǔ)上進(jìn)行篩選，篩選方法同“１．２．2”。

１．２．５優(yōu)良突變株最優(yōu)發(fā)酵條件篩選

1）pH試驗(yàn)：將液體培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)至3、4、5、8、9、10，接種1%的優(yōu)良突變株。30℃、120r/min培養(yǎng)24h后，涂布平板，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)并測(cè)定培養(yǎng)液發(fā)酵力。

2）碳源試驗(yàn)：制備含3%的不同碳源（葡萄糖、果糖、麩皮、麥芽糖、甘露糖、乳糖）的培養(yǎng)液，接種1%的優(yōu)良突變株，30℃、120r/min培養(yǎng)24h后，涂布平板，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)并測(cè)定培養(yǎng)液發(fā)酵力。

3）氮源試驗(yàn)：制備含2%的不同氮源［蛋白胨、黃豆粉、酵母粉、牛肉膏、NaNO3、(NH4)2SO4］的培養(yǎng)液，接種1%的優(yōu)良突變株，30℃、120r/min培養(yǎng)24h后，涂布平板，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)并測(cè)定培養(yǎng)液發(fā)酵力。

4）接種量試驗(yàn)：制備100mL液體培養(yǎng)基，分別接種2％、4％、6％、8％、10％的優(yōu)良突變株，30℃、120r/min培養(yǎng)24h后，涂布平板，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)并測(cè)定培養(yǎng)液發(fā)酵力。

１．２．６正交試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，選擇４因素３水平進(jìn)行試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表１。

２結(jié)果與分析

２．１酵母菌的分離、純化結(jié)果

經(jīng)反復(fù)分離純化篩選出５種酵母菌，其菌落形態(tài)特征見(jiàn)表２。

２．２菌株發(fā)酵性能

將所篩選的５種酵母菌分別制成酒曲，測(cè)定其部分理化指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表３。由表３可知，酒曲Ｎ２、Ｎ４的水分含量均在１２％～１３％，酸度在１．１ｍｍｏｌ／１００ｇ以上，研究表明，酸度在０．９～１．３ｍｍｏｌ／１００ｇ的為一級(jí)酒曲，在０．６～０．９ｍｍｏｌ／１００ｇ的為二級(jí)酒曲［6］，因此這兩種酒曲已滿(mǎn)足一級(jí)酒曲的要求。Ｎ４號(hào)酒曲液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力均為最高，Ｎ２號(hào)酒曲次之。而Ｎ２號(hào)酒曲發(fā)酵力最大，Ｎ４次之。綜合考慮各項(xiàng)指標(biāo)，選擇Ｎ４號(hào)株菌作為出發(fā)菌種進(jìn)行紫外線誘變。

２．３Ｎ４號(hào)菌株的紫外線誘變致死率

由表４可知，紫外線處理對(duì)酵母菌有較強(qiáng)的致死作用。誘變時(shí)間越長(zhǎng)，致死率越高。當(dāng)致死率超過(guò)７５％時(shí)常引起正突變［１０］，因此選擇誘變３ｍｉｎ致死率為９７．１％的這４株菌株（記為Ｎ４－１、Ｎ４－２、Ｎ４－３、Ｎ４－４），誘變４ｍｉｎ致死率為９８．６％的２株菌株（記為Ｎ４－５、Ｎ４－６）和誘變５ｍｉｎ致死率為９９．３％的１個(gè)菌株（記為Ｎ４－７）做進(jìn)一步試驗(yàn)。

２．４突變株發(fā)酵性能比較

由表５可知，與對(duì)照相比，誘變４、５ｍｉｎ所得的突變株Ｎ４－５、Ｎ４－６和Ｎ４－７發(fā)酵力均有不同程度下降，呈現(xiàn)負(fù)突變。而誘變時(shí)間較短的Ｎ４－２、Ｎ４－３和Ｎ４－４３株突變株發(fā)酵力較誘變前均有不同程度提高，其中突變株Ｎ４－４的發(fā)酵力最好，其液化酶活力、糖化酶活力、蛋白酶活力和發(fā)酵力比對(duì)照菌株分別提高了６．７％、７．５％、８．１％和３９．０％。

２．５優(yōu)良菌株Ｎ４－４的遺傳穩(wěn)定性

根據(jù)突變株發(fā)酵力測(cè)定結(jié)果，對(duì)優(yōu)良菌株Ｎ４－４的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行分析，結(jié)果如表６所示。由表６可知，誘變后得到的優(yōu)良菌株Ｎ４－４經(jīng)３代傳遞，菌株發(fā)酵力仍保持較高水平，而且比較穩(wěn)定，說(shuō)明突變株已具有穩(wěn)定的遺傳性狀。

２．６優(yōu)良菌株Ｎ４－４的最優(yōu)發(fā)酵條件研究

２．６．１酵母菌發(fā)酵的最適ｐＨ由表７可知，ｐＨ對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)和發(fā)酵能力影響較大，ｐＨ為３～５時(shí)，菌落數(shù)和發(fā)酵力均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)；ｐＨ為５時(shí)菌落數(shù)和發(fā)酵力均為最大，分別為２．６×１０１１ＣＦＵ／ｍＬ和０．８６５ｇ/（ｇ·７２ｈ），然后隨ｐＨ再增大，菌落數(shù)和發(fā)酵力均呈下降趨勢(shì)。

２．６．２酵母菌最適碳源由表８可知，Ｎ４－４酵母菌對(duì)不同糖類(lèi)物質(zhì)的利用能力差異較大。當(dāng)碳源為葡萄糖時(shí)，菌落數(shù)和發(fā)酵力均達(dá)到最大，分別為６．５×１０１１ＣＦＵ／ｍＬ、０．９１３ｇ/（ｇ·７２ｈ）；當(dāng)碳源為乳糖時(shí)，菌落數(shù)為５．３×１０７ＣＦＵ／ｍＬ，發(fā)酵力為０．３６３ｇ/（ｇ·７２ｈ），遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于葡萄糖為碳源時(shí)的菌落數(shù)和發(fā)酵力。

２．６．３酵母菌最適氮源由表９可以看出，氮源為（ＮＨ４）２ＳＯ４時(shí)，酵母菌Ｎ４－４菌落數(shù)和發(fā)酵力均為最佳，分別為２．２×１０１１ＣＦＵ／ｍＬ、０．６８９ｇ/（ｇ·７２ｈ），因此，選擇（ＮＨ４）２ＳＯ４為酵母菌培養(yǎng)最適氮源。

２．６．４酵母菌最適接種量由表１０可以看出，接種量為４％時(shí)，酵母菌Ｎ４－４菌落數(shù)和發(fā)酵力均達(dá)到最大，分別為２．２×１０１１ＣＦＵ／ｍＬ、０．７３８ｇ/（ｇ·７２ｈ），當(dāng)接種量大于４％時(shí)，酵母菌Ｎ４－４菌落數(shù)和發(fā)酵力隨接種量的增大而降低。

２．７正交試驗(yàn)結(jié)果

由表11可知，4個(gè)因素對(duì)酵母菌N4-4發(fā)酵影響的大小次序?yàn)閜H＞(NH4)2SO4＞葡萄糖＞接種量。4個(gè)因素的最佳配比為A2B2C3D1，即葡萄糖3%、pH5.0、接種量3%、(NH4)2SO43%。在此種配比的發(fā)酵培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)48h后，酵母菌N4-4發(fā)酵力可達(dá)0.978g/（g·72h）。

３討論

本研究通過(guò)平板分離、紫外線誘變篩選出１株糖化酶活力、液化酶活力、蛋白酶活力旺盛的酵母突變株N4-4，并通過(guò)正交試驗(yàn)確定了該突變株的最佳發(fā)酵條件為３％葡萄糖、３％（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ５．０、３％接種量、發(fā)酵溫度３０℃。本研究雖然對(duì)分離的酵母菌進(jìn)行了選育，使其發(fā)酵性能有了很大程度的提高，但該酵母突變株制作麩曲或大曲后，再次釀造白酒，能否提高白酒產(chǎn)量和品質(zhì)等問(wèn)題還有待進(jìn)一步研究。

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