1馬鈴薯抗黑脛病鑒定評價技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了馬鈴薯抗黑脛病的鑒定的術(shù)語和定義、培養(yǎng)基、接種體制備、接種、病情調(diào)查和抗病性評價等內(nèi)容。本文件適用于內(nèi)蒙古地區(qū)馬鈴薯品種在室內(nèi)條件下對黑脛病抗性水平的鑒定。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1馬鈴薯黑脛病Potatoblackleg馬鈴薯黑脛病是由果膠桿菌屬（Pectobacteriumsp.）、歐文氏菌(Erwiniacarotovora)引起的細(xì)菌性病害。病原菌可以通過傷口直接侵染，還可以通過灌水、昆蟲、土壤等傳播。感病植株的莖基變黑，嚴(yán)重時呈水漬狀腐爛，逐漸擴(kuò)展到莖上部，引起葉片出現(xiàn)卷曲皺縮、褪綠黃化等現(xiàn)象，最終莖稈腐爛，植株全部枯死。4培養(yǎng)基LBA培養(yǎng)基：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10gNaCl，15g瓊脂粉，1000mL去離子水,121℃滅菌15min。LB液體培養(yǎng)基：不加瓊脂粉，其余同LBA5接種體制備5.1病原物分離從發(fā)病馬鈴薯植株的發(fā)病部位采用組織分離結(jié)合單菌落分離病原物，分離物經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特性和分子序列鑒定為馬鈴薯黑脛病病原菌，經(jīng)柯赫氏法則驗證其致病性后保存?zhèn)溆谩?.2菌懸液的配置取100μl在-80℃保存的分離病原菌涂抹于LBA固體培養(yǎng)基上，28℃復(fù)壯48h。挑取菌落于100mLLB液體培養(yǎng)基中，28℃、180r/min培養(yǎng)48h，用平板計數(shù)法調(diào)節(jié)菌懸液濃度至106cfu/mL。6接種6.1溫室盆栽莖桿注射接種法26.1.1馬鈴薯準(zhǔn)備每個馬鈴薯品種選擇形態(tài)完好、無明顯傷病的馬鈴薯種薯種植在容積4L、裝有無菌的細(xì)沙與腐殖土等量混勻的盆中，16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)，濕度在70%，溫度控制在25℃。采用隨機(jī)區(qū)組排列盆栽，待馬鈴薯植株長出高約7~8cm用于接種。6.1.2接種用無菌牙簽戳傷植株的莖基部，移液槍吸取10μL106cfu/mL的菌懸液，注射于馬鈴薯植株莖基部，以接種等量LB培養(yǎng)基的處理作為對照，接種后將植株置于適宜的溫度（25-28℃)和濕度（90%以上）環(huán)境條件下培養(yǎng)。6.2離體薯塊接種法6.2.1接種體制備選取無傷病的各品種馬鈴薯于1%的次氯酸鈉溶液浸泡5min進(jìn)行消毒，無菌水清洗3次后晾干備用。6.2.2接種在每個馬鈴薯中央打一個4mm直徑×2mm深的圓孔，加入10μl菌懸液，置于鋪有滅菌紗布的盆中保濕，25℃的培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。每個品種設(shè)置3次重復(fù)，接種等劑量的無菌水作為對照。7病情調(diào)查觀察發(fā)病情況，溫室盆栽莖桿注射接種法測量發(fā)病馬鈴薯莖基部的病斑直徑，以接種點(diǎn)為中心測定上下各5cm范圍內(nèi)的發(fā)病面積占調(diào)查面積的比率進(jìn)行分級和抗性評價。調(diào)查離體薯塊接種36h后的發(fā)病情況，測量腐爛區(qū)域的病斑直徑，沿接種點(diǎn)縱切，測量薯塊縱切面接種點(diǎn)以下腐爛區(qū)域的深度和寬度（mm），以其乘積的值的平均數(shù)代表腐爛區(qū)域的切面面積，切片面積/100得到腐爛程度（cm2）?！{(diào)查范圍內(nèi)無病狀發(fā)生，抗病等級為0；——發(fā)病面積占調(diào)查面積25%以下，抗病等級為1級；——發(fā)病面積占調(diào)查面積25%～50%，抗病等級為2級；——發(fā)病面積占調(diào)查面積50%～75%級，抗病等級為3級；——發(fā)病面積占調(diào)查面積75%～100%級，抗病等級為4。8抗病性評價計算抗病等級平均值，以抗病等級平均值評價抗病性：發(fā)病面積為0～1