ICS?FORMTEXT點擊此處添加ICS號FORMTEXT點擊此處添加中國標準文獻分類號FORMTEXT?????DBFORMTEXT36DBFORMTEXTXX/FORMTEXTXXXXX—FORMTEXTXXXXFORMTEXT?????FORMTEXT柑橘衰退病毒基因型鑒定技術(shù)規(guī)程FORMTEXTTechnicalregulationsforgenotypeidentificationofCitrustristezavirusFORMTEXT點擊此處添加與國際標準一致性程度的標識FORMDROPDOWNFORMTEXT?????FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發(fā)布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實施FORMTEXT江西省市場監(jiān)督管理局???發(fā)布DBXX/XXXXX—XXXX柑橘衰退病毒基因型鑒定技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了實驗室鑒定柑橘衰退病毒基因型的RT-PCR技術(shù)要求。本文件適用于柑橘類植物感染柑橘衰退病毒的RT-PCR檢測和基因型鑒定。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB5040柑橘苗木產(chǎn)地檢疫規(guī)程術(shù)語與定義柑橘衰退病毒Citrustristezavirus，CTV柑橘衰退病毒是引起柑橘衰退病的病原病毒，屬于長線形病毒科（Closteroviridae）、長線形病毒屬（Closterovirus）。反轉(zhuǎn)錄·聚合酶鏈反應(yīng)ReverseTranscription-polymeraseChainReaction,RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(ReverseTranscription)和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。柑橘衰退病毒基因型信息柑橘衰退病毒顆粒細長彎曲，粒子大小約為11×2,000nm。病毒基因組由一條長約19.3kb的正單鏈RNA（+ssRNA）所組成。柑橘衰退病毒存在復(fù)雜的株系分化現(xiàn)象，包括VT、RB、T3、T30、T36、T68等不同基因型的株系。方法原理根據(jù)柑橘衰退病毒外殼蛋白基因（Coatproteingene,CPG）內(nèi)的保守區(qū)域設(shè)計特異性引物CPG-F/CPG-R，通過RT-PCR檢測樣品是否攜帶柑橘衰退病毒。然后利用柑橘衰退病毒VT、RB、T3、T30、T36、T68六種基因型的特異性引物，對已經(jīng)確定攜帶柑橘衰退病毒的樣品進行RT-PCR，并根據(jù)凝膠電泳結(jié)果進行基因型鑒定。田間癥狀識別柑橘衰退病的田間癥狀具有一定的復(fù)雜性，根據(jù)指示植物表現(xiàn)的表型可分為3種癥狀類型：苗黃型（Seedingyellow，SY）、速衰型（Quickdecline，QD）和莖陷點型（Stempitting，SP）。其中苗黃型會引起幼苗的黃化，速衰型引起根系死亡，造成整個植株的快速死亡，田間以莖陷點型癥狀發(fā)生較為普遍，主要引起甜橙、柚類和檸檬等柑橘的木質(zhì)部出現(xiàn)黃褐色斑點并伴有凹陷，嚴重時陷點呈蜂窩狀分布，造成樹勢衰弱、果實產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降，導(dǎo)致果樹喪失經(jīng)濟價值。具體癥狀特征見附錄A。鑒定方法7.1樣品采集與保存7.1.1田間果園疑似癥狀植株樣品取樣，優(yōu)先挑取疑似癥狀葉片。若未發(fā)現(xiàn)疑似葉片，即按照樹冠東、南、西、北四個方向采集，每點取中下部成熟嫩葉五片，每棵樹共采集葉片20張。7.1.2苗圃取樣時優(yōu)先挑取疑似癥狀植株，未發(fā)現(xiàn)疑似癥狀時可按照抽檢方規(guī)定抽檢率隨機抽取一定數(shù)量的植株，每株種苗抽取中下部成熟嫩葉5片。7.2樣品的保存采集的樣品分別用樣品袋進行分裝，放入適量浸潤的紙巾進行樣品的保濕，做好每個樣品的記錄，將樣品記錄和樣品3d內(nèi)一并寄送實驗室進行檢測。對接收樣品進行登記編號，存放于4℃條件下，及時進行樣品RNA核酸抽提。7.3主要的設(shè)備儀器和試劑7.3.1設(shè)備儀器普通PCR擴增儀。7.3.2主要試劑除非另有說明，本標準所用試劑均為分析純。特異性引物對（10μM）RNA酶抑制劑（40U/μL）反轉(zhuǎn)錄酶（5U/μL）TaqDNA聚合酶（5U/μL）TRIzolReagent核酸提取試劑綠色核酸染料7.4樣品的預(yù)處理與核酸抽提7.4.1樣品的預(yù)處理每份樣品選取5片葉片。使用一次性刀片，切取葉片中部主脈及側(cè)脈部分，每份樣品取樣重量控制在0.1g左右。7.4.2樣品的RNA提取按照以下步驟進行：（1）取0.1g帶有葉脈的葉片部分，迅速將葉片投入液氮中，然后放入研缽中迅速研磨直到成為粉末狀；快速挑取研磨好的粉末置于含有1mLTRIzolReagent裂解液預(yù)冷離心管中，并劇烈混勻，4℃靜置15min；（2）4℃，12900r/min離心10min，取上清液約800μL于1.5mL無酶離心管中，加入約1/5體積預(yù)冷氯仿:異戊醇（24:1），劇烈震蕩后4℃靜置5min；（3）4℃，12900r/min離心5min，取上清約400μL轉(zhuǎn)至新1.5mL無酶離心管，加入等體積異丙醇，并輕柔混勻，置于-20℃冰箱靜置沉淀2h以上；（4）4℃，12900r/min離心10min，去上清，加入1mL預(yù)冷75%酒精進行清洗，4℃12900r/min離心3min，去上清，重復(fù)2次；（5）除去多余酒精、風干10min，加入30μL滅菌水溶解，并4℃8000r/min離心1min；質(zhì)檢達標RNA于-20℃儲存?zhèn)溆谩?.5抽提樣品RNA的RT-PCR擴增7.5.1cDNA合成體系見表1，體系總體積15μL柑橘衰退病毒cDNA合成體系試劑（Reagent）每管用量（(Volume，μL）①10μmol/L隨機引物（6N）12.5mMdNTPs1模板RNA3②5×RTBuffer4RNA酶抑制劑（40U/μL）0.5反轉(zhuǎn)錄酶（5U/μL）1DEPCH2O4.5合計157.5.2反轉(zhuǎn)錄引物為6N：NNNNNN。7.5.3反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序：在PCR管中加入5μL的反轉(zhuǎn)錄混合物①，混勻后在65℃下預(yù)熱解鏈10min；將10μL的混合物②加入并混勻，進行下一步：30℃反應(yīng)10min，42℃反轉(zhuǎn)錄40min，70℃加熱5min。7.5.4PCR擴增體系擴增體系見表2，體系總體積為25μL。柑橘衰退病毒PCR擴增體系試劑（Reagent）每管用量（(Volume，μL）10×PCRBuffer4.510μmol/L上游引物（F）0.510μmol/L下游引物（R）0.52.5mMdNTPs2r-TaqDNA聚合酶0.4cDNA1DEPCH2O16.1合計257.5.5樣本柑橘衰退病毒PCR檢測的特異引物CPG-F/CPG-R，引物序列為：CPG-F:CTGCTTTAAGGGTCGTTAATTG，CPG-R:TGAAACTCCACCATCCCGAT。7.5.6柑橘衰退病毒基因型鑒定PCR擴增用特異引物信息見附錄B。PCR反應(yīng)程序：94℃變性5min；94℃變性30s，54-58℃退火30s（根據(jù)附錄B表3不同基因型退火溫度來設(shè)定），72℃延伸60s/kb，循環(huán)35次；72℃延伸5min，12℃保存30min。7.5.7瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物電泳程序：取5～7μLPCR產(chǎn)物，加1μL6×loadingbuffer，充分混合后，上樣于1.2%瓊脂糖膠膠孔中，100V，電泳30min，經(jīng)綠色核酸染料染色后，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。結(jié)果判定待檢樣品核酸經(jīng)RT-PCR擴增后，產(chǎn)物經(jīng)電泳于凝膠成像系統(tǒng)觀察，凝膠上陽性對照出現(xiàn)一條大小為771bp的特異性條帶，陰性對照沒有任何擴增條帶，表示檢測過程正常，方可進入下一步驟。待檢樣品若出現(xiàn)與陽性對照相同大小的771bp特異性條帶，則判定該樣品為陽性，即攜帶柑橘衰退病毒，若未出現(xiàn)771bp特異性條帶，則判定樣品為陰性，即未攜帶柑橘衰退病毒。將攜帶柑橘衰退病毒的樣品核酸經(jīng)RT-PCR擴增后，產(chǎn)物經(jīng)電泳于凝膠成像系統(tǒng)觀察，凝膠上陽性對照出現(xiàn)583bp（VT）、316bp（RB）、417bp（T3）、590bp（T30）、175bp（T36）、491bp（T68）特異性條帶，陰性對照沒有任何擴增條帶，表示檢測過程正常，方可進入下一步驟。待檢樣品若出現(xiàn)與陽性對照相同大小的特異性條帶，則判定樣品攜帶的柑橘衰退病毒為該類型的基因型。

（資料性）

柑橘衰退病癥狀苗黃型引起幼苗的黃化；速衰型引起根系死亡，造成整個植株的快速死亡；莖陷點型使植株木質(zhì)部形成大小不一凹陷點（圖A.1）。柑橘衰退病癥狀A(yù)：苗黃型；B：速衰型；C：莖陷點型注：B圖來自MorenoP,AmbrósS,Albiach-MartíMR,GuerriJ,Pe?aL.Citrustristezavirus:apathogenthatchangedthecourseofthecitrusindustry.MolPlantPathol.2008,9(2):251-268.

柑橘衰退病毒基因型鑒定引物柑橘衰退病毒基因型鑒定引物信息基因型引物引物序列（5′-3′）片段長度標記位置退火溫度VTVT-F/RF:GGAGTCGGACGGGCGGTTCTTTGR:ATARCAGTAACCGTCCTTCAGGTCT583bp2170-275354℃RBRB-F/RF:CTATTGATGTTGGTTATRACGTTGATGR:ACTGCGTTCGCTAGTGACATTATC316bp11108-1142455℃T3T3-F/RF:TCGGATRTRTTACCTGGCGCAACR:ACTGCGACGGAATGCTCTATTAATC417bp6291-670854℃T30T30-F/RF:CCCG