靜注加替沙星在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究靜注加替沙星在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.了解加替沙星的藥理學(xué)作用和臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)方法；2.熟悉家兔靜脈注射藥物和股動(dòng)脈采血的操作；3.建立測(cè)定家兔血清中加替沙星藥物濃度的高效液相方法；4.掌握分析數(shù)據(jù)的方法以得到相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。二．背景：喹諾酮類藥物是一種DNA旋轉(zhuǎn)酶抑制劑,它作用于細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶,干擾DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的解旋,從而阻礙DNA的復(fù)制,而呈現(xiàn)殺菌作用。該類藥物的共同特點(diǎn)是:抗菌作用強(qiáng)大,抗菌譜較廣,主要對(duì)抗革蘭陰性菌,對(duì)革蘭陽(yáng)性菌也有相當(dāng)作用。加替沙星（Gatifloxacin）為第三代喹諾酮類藥物，為8-甲氧氟喹諾酮類外消旋化合物，體外具有應(yīng)譜的抗革蘭氏陰性和陽(yáng)性微生物的活性，其R-和S-對(duì)映體抗菌活性相同。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)告，加替沙星口服吸收良好，且不受飲食因素影響，其絕對(duì)生物利用度為96%，藥物濃度在服用1-2小時(shí)后達(dá)峰。他體內(nèi)的分布較廣,可進(jìn)入大多數(shù)藥物不能進(jìn)入的骨、關(guān)節(jié)和前列腺組織等。加替沙星的臨床有效性評(píng)價(jià)在國(guó)外報(bào)道較多,而國(guó)內(nèi)關(guān)于加替沙星臨床試驗(yàn)的報(bào)道較少。在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)健康家兔耳緣靜脈注射加替沙星之后，藥物會(huì)在體內(nèi)血液中進(jìn)行二房室模型分布，分別在不同時(shí)刻進(jìn)行血液采集，用高效液相色譜法對(duì)各時(shí)刻血漿內(nèi)藥物濃度進(jìn)行檢測(cè)，可以繪制加替沙星注射液在家兔體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)曲線，并可以據(jù)此進(jìn)行相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算。三．實(shí)驗(yàn)試劑與儀器：3.1動(dòng)物：健康家兔1只（雌雄均可）3.2試劑：加替沙星氯化鈉注射液，1mg/ml加替沙星溶液，20%烏拉坦，肝素生理鹽水，10%高氯酸，90%甲醇，醋酸銨15mM/L，醋酸，乙腈，蒸餾水3.3儀器：恒溫兔臺(tái)，手術(shù)儀器一套，頭皮針，注射器，抗凝管，動(dòng)脈夾，插管，棉線SHIMADZUHPLC色譜儀:SHIMADZUCTO-10AS柱溫箱，LC-20AT液相色譜儀，SPD-20A紫外檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，數(shù)據(jù)處理工作站，高速離心機(jī)，渦旋震蕩儀四．實(shí)驗(yàn)條件及試劑選擇：4.1取血點(diǎn)的選擇對(duì)于一個(gè)較完整的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)曲線，采血時(shí)間點(diǎn)應(yīng)至少在吸收相取2個(gè)，平衡相去2個(gè)，消除相取5個(gè)，保證取血持續(xù)時(shí)間為3-5個(gè)半衰期，最后一個(gè)取血點(diǎn)處藥物濃度至少低于110Cmax。對(duì)于加替沙星消除半衰期t1/2=1.4292(h),因此本實(shí)驗(yàn)中取血點(diǎn)定在2,5,10,15,30,45,60,90,120min。4.2取血方式及血量鑒于如果采用頸動(dòng)脈會(huì)影響家兔呼吸，而且給藥時(shí)家兔雙耳分別用于麻醉和加替沙星的給藥，但動(dòng)脈血量更豐富，因此本次實(shí)驗(yàn)采用耳緣給藥，股動(dòng)脈插管取血。由于家兔血量有限，其中血漿量占全血量40-50%，血清量?jī)H占全血量10%左右，因此在不影響家兔生存，且可以得到足夠分析需要樣本量的條件下，本次實(shí)驗(yàn)采用家兔全血提取的血漿進(jìn)行檢測(cè)，每次取血0.5ml。4.3樣品處理 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和采集的9個(gè)血樣濃度的測(cè)定應(yīng)平行操作。由于實(shí)驗(yàn)時(shí)間的關(guān)系，我們分兩次操作。但處理方法需保持平行：100μl血漿（標(biāo)準(zhǔn)液10μl和空白血漿90μl）+100μl10%高氯酸渦旋振蕩3min,12000rmp離心10min進(jìn)而取上清進(jìn)樣。這樣標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的時(shí)候的濃度為在加入空白血漿后的這100μl體系的濃度。4.4色譜條件色譜柱：C184.6×150mm流動(dòng)相：水相：醋酸銨15mM/L，用醋酸調(diào)至PH3.0有機(jī)相：乙腈水相：有機(jī)相=78:22流速：1ml/min檢測(cè)波長(zhǎng)294nm柱溫：40℃檢測(cè)順序：由低濃度到高濃度五．實(shí)驗(yàn)步驟：5.1給藥及取血取家兔一只，稱重，將家兔以烏拉坦5ml/kg麻醉，背位固定于手術(shù)臺(tái)上。在一側(cè)腹股溝部搏動(dòng)處剪毛，用1ml1%鹽酸普魯卡因作皮下局麻?？v切皮膚3~4cm，分離股動(dòng)脈，在動(dòng)脈下穿雙線，結(jié)扎近心端，作靜脈切口，插入與注射器相連的靜脈插管（內(nèi)充滿肝素化鹽水），結(jié)扎固定，檢查取血是否順利。耳緣靜脈給藥加替沙星1ml/kg，藥物全部推入之后立即開(kāi)始計(jì)時(shí)，于2,5,10,15,30,45,60,90,120min處取血各0.5ml，加入抗凝劑渦旋混勻，高速離心(4000r/min)15min。取上層清夜，靜置冷藏保存。5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制5.2.1標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)溶液配制由1mg/ml的加替沙星母液稀釋配制500μg/ml,250μg/ml,125μg/ml,62.6μg/ml,31.2μg/ml,15.6μg/ml,7.8μg/ml,3.9μg/ml系列濃度的加替沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液。各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液取10μl分別加入90μl空白血漿中，混勻，分別加入10%高氯酸100μl，渦旋震蕩3min以去除蛋白。高速離心12000r/min，取上層清夜100μl供HPLC檢測(cè)。5.2.2HPLC檢測(cè)以流動(dòng)相沖洗HPLC泵1h，打開(kāi)工作站準(zhǔn)備記錄數(shù)據(jù)。檢測(cè)前用90%甲醇洗閥并洗進(jìn)樣針，進(jìn)樣濃度從低到高進(jìn)行檢測(cè)，每次進(jìn)樣量20μl，記錄各濃度的色譜峰保留時(shí)間和峰面積，并繪制“色譜峰面積—濃度”標(biāo)準(zhǔn)曲線。5.3實(shí)測(cè)樣品檢測(cè)在實(shí)測(cè)血漿樣品取100μl，加入100μl10%高氯酸，渦旋震蕩3min去除蛋白。高速離心12000r/min，取上層清夜100μl供HPLC檢測(cè)。檢測(cè)方法同5.2.2。六．實(shí)驗(yàn)結(jié)果：6.1加替沙星濃度-出峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制藥物濃度C(ug/mL)0.390.781.563.126.2512.5025.0050.00峰面積A163452384749412819381831513483737081361453510由上表中的數(shù)據(jù)可得下圖中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得到現(xiàn)行方程為A=28936*C-2169.3，R2=0.9997，其中C的單位為ug/mL6.2實(shí)測(cè)各取樣點(diǎn)的加替沙星濃度的計(jì)算取樣時(shí)間T(min)25101530456090120出峰面積A987391511149409586316279253166206074193756180616154150藥物濃度ug/mL34.2017.7414.2311.008.827.206.776.325.40由實(shí)驗(yàn)測(cè)得數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算可得上表中第三列的加替沙星濃度。6.3藥時(shí)曲線6.4藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)利用殘數(shù)法估算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)：時(shí)間（h）血藥濃度實(shí)測(cè)值CLN（C）外推濃度殘數(shù)濃度Ln（C殘）血藥濃度計(jì)算值實(shí)測(cè)值-計(jì)算值0.03333334.198240959.36199224.83624893.53217420837.52896-3.3307190530.08333317.73978099.2296758.510105872.87580962631.46734061-13.727559710.16666714.229862469.0132895.216573122.65534274624.01028803-9.7804255770.2511.005263348.8019772.203286632.39837364418.91589668-7.9106333370.58.824139482.17749111.29946744-2.4753279590.757.1966857891.973621correl?=-0.927642978.585670203-1.38898441316.7709876971.912647slope(α)-4.7272488557.40156485-0.6305771531.56.3168820851.843226intercept=3.4957249036.1938858380.12299624725.4022428811.686814A=32.974182395.3508757670.051367114correl?=-0.95263slope(β)=-0.28469intercept=2.246148B=9.451256我們組所做的單劑量靜脈注射二房室模型表達(dá)式為：C=32.97418e-4.7272t+9.4513e-0.28469t其他參數(shù)：初始濃度(C0)：t=0,C0=A+B=42.43ug/mL消除速率常數(shù)(k):-0.2847分布半衰期(t1/2α):0.693/α=0.1466h消除半衰期(t1/2β):0.693/β=2.43h平均駐留時(shí)間(MRT):AUMC/AUC=1.709h血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC):35.094ug/mL·h清除率(CL)：k*Vd=0.9395mL/kg/h表觀分布容積(Vd)：3.3004ml七．討論1.采血：每只兔耳耳緣靜脈有兩條，采血前均應(yīng)備齊，以免采血時(shí)不慎將血管破壞后不能及時(shí)采血；采集血樣時(shí)應(yīng)從耳尖向耳根方向依次取血，如任意采血，后幾個(gè)點(diǎn)因血管被破壞而無(wú)法采到；每次采血時(shí)應(yīng)先使其劇烈運(yùn)動(dòng)，加速血液循環(huán)，便于采血；采血還應(yīng)注意采血手法，應(yīng)用中指墊著耳背，食指與無(wú)名指確定采血區(qū)間，快而穩(wěn)地進(jìn)針，抽血時(shí)要慢，因耳緣靜脈血管較細(xì)，如抽血過(guò)快血管易抽癟，無(wú)法采血。從給藥后開(kāi)始計(jì)時(shí)，取血一定要提前1分鐘左右準(zhǔn)備，否則會(huì)錯(cuò)過(guò)時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生誤差。尤其是前期血藥濃度變化很大的階段。因?yàn)槿〉氖茄澹枰妊耗毯笤匐x心方得到血清，若使用的是血漿，則需要馬上離心。2.樣品處理：本實(shí)驗(yàn)采用高氯酸作為蛋白沉淀劑而不用甲醇和乙腈的原因有：（1）：本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相條件偏酸性，而高氯酸的上清液是在酸性條件下產(chǎn)生的；（2）同樣在酸性條件下，高氯酸的蛋白沉淀率高于甲醇和乙腈。高