第十一章遺傳工程

利用轉(zhuǎn)基因手段對(duì)生物進(jìn)行人為改造的技術(shù)第11章遺傳工程什么是遺傳工程？

體外DNA重組技術(shù)：利用工具酶將外源片段和載體連接，導(dǎo)入生物體并使其穩(wěn)定復(fù)制和傳代的技術(shù)目的研究工作生物產(chǎn)品(生物反應(yīng)器)改良物種(提高品質(zhì))基因治療第11章遺傳工程工具酶A.剪切酶類(lèi)有目的有選擇的把目的片段切開(kāi)B.連接酶類(lèi)將目的片段和載體相連C.其他工具酶修飾,加工等作用第11章遺傳工程限制性內(nèi)切酶II及其產(chǎn)生的3種不同末端5'突出的粘性末端3'突出的粘性末端平末端EcoRIEcoRVPstIPPPPPP第11章遺傳工程同切酶和同粘酶同切酶:

識(shí)別相同的位點(diǎn),但生成不同的末端.同粘酶:

識(shí)別不同的位點(diǎn),但產(chǎn)生相同的粘性末端第11章遺傳工程SmaI

5′...CCC^GGG...3′3′...GGG^CCC...5′XmaI

5′...C^CCGGG...3′3′...GGGCC^C...5′同切酶BamHI

5′...G^GATCC...3′3′...CCTAG^G...5′BglII5′...A^GATCT...3′3′...TCTAG^A...5′同粘酶Sau3A5′...^GATC...3′3′...CTAG^...5′第11章遺傳工程連接酶及其對(duì)底物的要求:T4Ligase,EcoliLigase底物:自由5’末端和自由3’末端,5’末端帶磷酸基團(tuán)反應(yīng)條件：Mg++，ATP存在第11章遺傳工程聚合酶(polymerase):DNA聚合酶I,klenow片段,Taq,Pfu,末端轉(zhuǎn)移酶外切核酸酶(exonuclease):exoIII,S1核酸酶,DNaseI脫磷酸酶(dephosphatase):堿性磷酸酯酶CIP磷酸化酶,激酶(kinase)逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)RNaseH,RNaseA甲基化酶(methylase)其它工具酶第11章遺傳工程載體及其構(gòu)成基本要素能獨(dú)立復(fù)制并穩(wěn)定傳代:復(fù)制起始點(diǎn)ori或自主復(fù)制序列ARS和著絲粒,端粒方便插入外源片段:單酶切位點(diǎn)選擇標(biāo)記:藥物抗性報(bào)告基因:插入篩選標(biāo)記易分離提取高產(chǎn)率（多拷貝）強(qiáng)啟動(dòng)子多宿主第11章遺傳工程常用載體質(zhì)粒(plasmid)，粘粒(cosmid)，噬菌體，噬粒(phagemid),病毒，PAC，YAC，BAC特殊用途的載體表達(dá)型載體，分泌型載體，穿梭載體第11章遺傳工程宿主繁殖快,易于培養(yǎng),能夠快速得到產(chǎn)物對(duì)所攜帶基因的表達(dá)產(chǎn)物具有較高耐受性,具有克隆最多種基因的可能突變率低,能夠穩(wěn)定忠實(shí)的保存被克隆基因第11章遺傳工程常用宿主大腸桿菌:繁殖快,易培養(yǎng),易分離產(chǎn)物噬菌體:轉(zhuǎn)化效率高,易于保存酵母:繁殖最快的真核生物,適于有蛋白質(zhì)加工的基因表達(dá)第11章遺傳工程lacZ第11章遺傳工程

第11章遺傳工程第11章遺傳工程

第11章遺傳工程第11章遺傳工程第11章遺傳工程如何提高克隆效率?提高插入片段和載體的比例盡可能采用粘端連接*載體脫磷以降低載體自連插入片段磷酸化改進(jìn)轉(zhuǎn)化條件第11章遺傳工程問(wèn)題:

有一外源片段用某種酶切,生成了5′突出粘性末端5′-GATC,但是載體上的單酶切位點(diǎn)只能生成下面這幾種粘性末端:5′-CTAG5′-TCGA5′-TTAA應(yīng)當(dāng)采用怎樣的策略來(lái)提高連接效率?第11章遺傳工程不依賴于內(nèi)切酶和連接酶的體外重組

位點(diǎn)專一性重組（依賴于短片段同源序列的重組）cosN,LoxP第11章遺傳工程LoxPLoxPcreLoxPLoxP第11章遺傳工程Transform+reportgenesubstrates第11章遺傳工程第11章遺傳工程第11章遺傳工程新鮮組織研磨或勻漿RNA提取液總RNA過(guò)oligo(dU)柱洗脫mRNAAAAAAAAATTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAAArRNAtRNAmRNA第11章遺傳工程第11章遺傳工程第11章遺傳工程篩選DNA文庫(kù)用標(biāo)記的核酸作為探針用誘餌質(zhì)粒篩選表達(dá)cDNA文庫(kù)第11章遺傳工程探針標(biāo)記標(biāo)記物：同位素標(biāo)記：32P非放射性標(biāo)記：熒光標(biāo)記，生物素，dig(地高辛）等第11章遺傳工程變性模板DNA隨機(jī)6核苷酸引物，dNTP,某種標(biāo)記dNTPDNAPolI5‘隨機(jī)引物標(biāo)記的DNA片段第11章遺傳工程SynthesizeRadioactivePROBEPurifiedtempleteKlenow,randomprimerprobe第11章遺傳工程第11章遺傳工程第11章遺傳工程第11章遺傳工程REMOVEREMOVEInsertedDNAcodingProteinfordetectionGAL4-ADlacZbaitDNA第11章遺傳工程InsertedDNAcodingProteinfordetectionGAL4-ADlacZbaitDNABaitDNABaitDNA第11章遺傳工程PCR技術(shù)及其應(yīng)用應(yīng)用范圍：檢測(cè)和診斷（高靈敏度）基因克隆（eg:通過(guò)部分已知序列擴(kuò)增未知目標(biāo)片段第11章遺傳工程第11章遺傳工程第11章遺傳工程第11章遺傳工程第11章遺傳工程第11章遺傳工程其他常用分子生物學(xué)技術(shù)丙烯酰氨凝膠電泳（PAGE）脈沖電泳雙向電泳Southern雜交northern雜交western雜交第11章遺傳工程轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物和基因治療轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：醫(yī)學(xué)研究，生物制藥轉(zhuǎn)基因植物：改良品質(zhì)，提高抗逆能力基因治療：治療藥物無(wú)法根治的遺傳性疾病第11章遺傳工程iRNA作用原理第11章遺傳工程

第11章遺傳工程5′

CAUG

3′

mRNA

3′

GUAC

5′

AntisenseRNA反義RNA作用原理第11章遺傳工程轉(zhuǎn)基因植物實(shí)例轉(zhuǎn)入成熟酶atRNA后,西紅柿保存期延長(zhǎng)至1個(gè)月第11章遺傳工程基因治療

利用人工載體攜帶基因轉(zhuǎn)化人體細(xì)胞,植入遺傳病患者體內(nèi)后,外源基因表達(dá)產(chǎn)生活性產(chǎn)物,代償先天缺失或損壞基因的功能,使得遺傳病患者可以脫離日常藥物治療,健康生活.1990年美國(guó)首次對(duì)一名4歲的先天免疫缺陷患者進(jìn)行基因治療,獲得成功第11章遺傳工程血友病B