DB35DB35/T1822—2019水禽圓環(huán)病毒感染PCR鑒別診斷技術(shù)PCRdiagnostictechniquesfordifferentiatingcircovirusinfectioninwaterfowls2019-04-18發(fā)布2019-07-18實(shí)施福建省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布I 1 1 1 4 6 7本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：傅光華、施少華、黃勇、彭春香、傅秋玲、黃瑜、白泉陽(yáng)、葉洪、萬(wàn)春和、1水禽圓環(huán)病毒（Waterfowlcircovirus）為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的成員，主要包括鴨圓環(huán)病毒），）：3.2.11DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物：100bpladder。2發(fā)病鴨（鵝）的法氏囊、脾臟等器官，剪碎后與磷酸鹽緩沖液（PBS，見(jiàn)附錄A的A.8）按體積比1：5的比例制成組織勻漿液，反復(fù)凍融3次，8000r/min離心30min，取上清，用于DNA抽提，或置-20℃凍若采集的樣品需放置6h以上再進(jìn)行處理，應(yīng)先置-20℃條件下保存?zhèn)溆?，需托運(yùn)時(shí)應(yīng)確保冷藏或CVF：5′-AAYCWCGCGDuCVR：5′-TTCTARGCATAAACGoCVR：5′-ATAMGATTC其中，CVF為共用上游引物，CVF與DuCVR用于檢測(cè)DuCV，擴(kuò)增條帶為554bp大小的基因片段，CVF與GoCVR用于檢測(cè)GoCV，擴(kuò)增條帶為407bp大小的基因片段。各引物的工作濃度均為10mmol/L，保存于4℃~8℃條件下。3），反應(yīng)結(jié)束后，分別取待檢樣品、陰性對(duì)照樣品、陽(yáng)性對(duì)照樣品和空白對(duì)照樣品各5μLPCR產(chǎn)物使用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察核酸條帶并判斷結(jié)果，經(jīng)核酸擴(kuò)鴨圓環(huán)病毒樣品出現(xiàn)554bp大小的擴(kuò)增條帶（參見(jiàn)附錄C中圖C.1的3號(hào)泳道陽(yáng)性樣品混合物出現(xiàn)407bp和554bp大小的擴(kuò)增條帶（參見(jiàn)附錄C中圖C.1的4號(hào)泳道），空白對(duì)照樣品和陰性對(duì)照樣品均無(wú)），4A.23mol/L的醋酸鈉溶液(NaOA.5.1配制0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（稱取二水乙二銨四乙酸二鈉18.61g溶解于適量滅菌去離子水中，混勻后用10%氫氧化鈉溶液調(diào)pH羥基甲基氨基甲烷（Tris）242g0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液（pH8.0）50×TAE電泳緩沖液5置微波爐中加熱至完全融化，待冷至50℃~60℃時(shí)，加溴化乙錠（EB）溶液5μL，搖勻后倒入制KH2PO4將上述試劑溶于800mL蒸餾水中，定容至1000mL，1.034×105Pa高壓滅菌30min，4℃保存?zhèn)? AATCTCGCGGGAAGTGGTGGGATGGCTATAATGGGCAGGATGTGGTTGTGATGGATGATTTTTATGGGTGGCTCCCTTCCTTTTAAGGATCTGTGATCGCTATCCTTTACGGGTTGAGTATAAGGGTGGTATGACCCAGTTCGTGTCTAAGACCCTAATAGGGAGCCTCGCGATTGGTATAAATGCGAGTGTGATGTGTCGGCATTGTATCGGAGAATTAATCAGTACCTGATGGTTATGCGCCCGCCCCTGATTTTATGCTGCCGTTCCCAATAAACTACTAGAGACCTGGTTAAGGTTAGAATAGTGTAAAATTACAATAAAGTTATGGTGCAAGCCCAGTCCATTGTAACCACGCGGGAAGTGGTGGGACGGTTACTCGGGAAATGACGTAGTCGTCATGGACGACTTTTATGGTTGGTTGCCTTTTTGCTGAGAATTACCGACCGTTACCCTTTACGGGTTGAATTTAAAGGCGGTATGACTCAGTTTGTGGCTAAGACCTTGAGTAACCGCGAGCCTCGTGATTGGTACAAGAGCGAGTTTGACCTTTCAGCTCTGTACCGCAGAATTAACAAGTATCTTGTGGACAAGTACGAACCCGCCCAGGCATGTACCCTCCCGTTCCCAATAAACTACTGAGACCAATTTGCCGTGAGTCGTTTATTACTTGGCAGGGTATTACACTTGGGCAGCTCGGTTAAGGTTAGGCACTTGGCAGGGATTAAACACTTGGGCAGCTCGGTTAACTTGGCAGGGATTAAACACTTGGGCAGCTCGGTTAAGGTTAGGCACTTGGCA