35DB35/T1992—2021番鴨細(xì)小病毒和鵝細(xì)小病毒雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒別診斷技術(shù)Diagnostictechniqueofduplexreal-timefluorescentPCRforthedetectionofmuscovyduckparvovirusandgooseparvovirus福建省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布I 8 91本文件規(guī)定了鑒別檢測(cè)番鴨細(xì)小病毒（Muscovyduckparvovirus,MDPV）和鵝細(xì)小病毒（Gooseparvovirus，GPV）雙重實(shí)時(shí)熒光定量聚合NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)融解（解鏈）溫度meltingtemp核酸加熱變性過(guò)程中，紫外光吸收值達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度稱為核酸的解鏈溫度，并在PCR反應(yīng)體系中加入過(guò)量雙鏈嵌合熒光染料，熒光染料非特異性地?fù)饺朊撗鹾颂呛怂嵬ㄟ^(guò)重新加熱擴(kuò)增產(chǎn)物（反應(yīng)溫度逐漸升高使結(jié)合了熒光染料分子的雙鏈DNA解離或“融解”鏈DNA，熒光強(qiáng)度發(fā)生顯著變化，形成一幅融解曲線圖。由于上述兩個(gè)特異性片段的Tm值不同，造成不同的PCR產(chǎn)物融解曲線特性不一樣（出現(xiàn)峰值所對(duì)應(yīng)的溫度不同），通過(guò)分析擴(kuò)增后融解曲線，可單、直接地判斷實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物的目的基因片25.2PBS(磷酸鹽緩沖溶液):0.01mol/L(pH7.2)PBS的配制方法5.5蛋白酶K(10mg/mL)。5.7酚-氯仿-異戊醇混合液(25:24:1):在一滅菌棕色瓶中按25:24:1比例分別加入酚、氯仿、6.2高速冷凍離心機(jī)：可控溫至4℃,最大離心速度可達(dá)12000r/min3d)加等量的酚-氯仿-異戊醇(25:24:1),充分混勻，12000r/min離心5min,小心吸出上層e)加1/10體積3mol/L的乙酸鈉(pH5.4),2.5倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，12000r/min離心7.2熒光定量PCR檢測(cè)450.01mol/L（pH7.2）磷酸鹽緩沖液磷酸二氫鈉水溶液（NaH2PO4?H2O）27.磷酸氫二鈉水溶液（Na2HPO4?12H2O）71.6MDPV和GPV雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒別檢測(cè)方法所用引物見(jiàn)表B.1。5'-TAATGGTGGCAGGAATG7MDPV和GPV雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒別檢測(cè)反應(yīng)體系組分見(jiàn)表C.1。SYBRGreen熒光定量PCR酶混合物（aSYBRGreen熒光定量PCR試劑盒內(nèi)提供，內(nèi)含DNA聚合酶，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucl），8(資料性)MDPV和GPV雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒別檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線MDPV和GPV雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒別檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖D.1。Threshold121(AdjustedBaselinesetings:automatic,Dritcome圖D.1MDPV和GPV雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒別檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線9(資料性)MDPV和GPV雙