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DB61陜 西 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB61/T1815—2024化妝品修護功效測試技術(shù)規(guī)范TechnicalSpecificationforcosmeticsrepairefficacytest20242024040320240503陜西省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB61/T1815DB61/T1815—2024DB61/T1815DB61/T1815—2024目??次前言 II范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語和定義 1基本要求 2測試準(zhǔn)備 3測試 3數(shù)據(jù)分析 4測試報告 5質(zhì)量保證 5附錄A（資料性）圖片處理方法 6II前??言本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由陜西省藥品監(jiān)督管理局提出并歸口。本文件起草單位：陜西省食品藥品檢驗研究院、陜西博溪通用檢測科技有限公司、陜西省藥品和疫苗檢查中心、陜西省藥品技術(shù)審評中心、咸陽市食品藥品檢驗檢測中心。本文件主要起草人：蔡虎、劉海靜、馮潤東、曹涵博、楊文娟、吳小勇、黨琳琳、盧永波、李瀟、王莉芳、羅阿利、張若冰、李曉春。本文件首次發(fā)布。本文件由陜西省食品藥品檢驗研究院負責(zé)解釋。聯(lián)系信息如下：單位：陜西省食品藥品檢驗研究院電話編：710065II地址：陜西省西安市高新區(qū)科技五路21郵編：710065II化妝品修護功效測試技術(shù)規(guī)范范圍本文件適用于化妝品體外角質(zhì)形成細胞遷移率的測試。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB/T622 化學(xué)試劑鹽酸GB/T646 化學(xué)試劑氯化鉀GB/T678 化學(xué)試劑乙醇(無水乙醇)GB/T1266 GB/T1274 GB/T1266 GB/T1274 化學(xué)試劑磷酸二氫鉀GB/T6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T21395 二甲基亞砜SN/T3899 化妝品體外替代試驗良好細胞培養(yǎng)和樣品制備規(guī)范3術(shù)語和定義SN/T3899界定的以及下列術(shù)語及定義適用于本文件。3.1修護repair有助于維護施用部位保持正常狀態(tài)。3.2細胞遷移cellmigration指細胞在接收到遷移信號或感受到某些物質(zhì)的刺激后而產(chǎn)生的移動。3.3細胞鋪板率cellfusionrate細胞覆蓋培養(yǎng)皿的面積占培養(yǎng)皿總表面積的百分比。1基本要求環(huán)境要求100級要求，環(huán)境溫度應(yīng)控制在20℃～24℃，環(huán)境濕度應(yīng)控制在50%～70%，防震動，防電磁干擾。其他試驗操作應(yīng)在常規(guī)實驗室環(huán)境下進行，生物安全等級達到一級要求。耗材和試劑一般要求所用試劑應(yīng)為分析純，試驗用水應(yīng)按GB/T6682的要求進行制備。與細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑、耗材應(yīng)作無菌處理。耗材耗材應(yīng)滿足下列要求：25cm2、75cm2；6孔平底細胞培養(yǎng)板；1.5mL、15mL、50mL；0.22μm；直尺長度≥15cm。試劑試劑應(yīng)滿足下列要求：GB/T213950.22μm；直尺長度≥15cm。試劑試劑應(yīng)滿足下列要求：GB/T21395的要求；GB/T678的要求；磷酸二氫鉀（KH2PO4）GB/T12745的要求；十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）GB/T12635的要求；氯化鈉（NaCl）GB/T12665的要求；氯化鉀（KClGB/T6465的要求；鹽酸（HCl）GB/T6225的要求；角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基；表皮細胞生長因子(EGF)純度≥95。試劑配制試劑配制應(yīng)滿足以下要求：（0.10.27g2.87g8.00g0.20g800mLpH7.41000mL，過14d；EGF溶液（1ng/mL）10ngEGF10mL1ng/mL28d。儀器設(shè)備2儀器設(shè)備應(yīng)符合以下要求：100倍～400倍；37℃，5CO2，95%相對濕度；0.0001g；100μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL；100級。測試準(zhǔn)備細胞準(zhǔn)備應(yīng)采用人源皮膚的原代角質(zhì)形成細胞，以角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)液于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。P72×105個細胞/6324h±2h用于試驗。2條線，兩2.0cm。樣品制備受試物的配制應(yīng)根據(jù)受試物理化特性選擇合適的溶劑配置成受試物工作液，配制要求如下：（母液中受試物的濃度應(yīng)為試驗濃10倍～1000倍），過濾除菌，然后使用細胞培養(yǎng)液稀釋到試驗濃度；（母100倍～1000倍），過濾除菌，其中二甲基亞砜或無水乙1%。受試物濃度的選擇應(yīng)通過細胞毒性試驗確定受試物安全濃度范圍，以受試物處理細胞后細胞活力≥90%時的濃度為安全濃度的最高濃度，在安全濃度范圍內(nèi)，選擇1個～3個濃度作為受試物試驗濃度。實驗分組試驗過程中應(yīng)按以下要求分組：空白對照組：使用角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞；1ng/mLEGF；受試物組：使用含有一定濃度的受試物的角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。測試受試物孵育3應(yīng)棄掉培養(yǎng)孔中的細胞培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液，操作過程按照5.3要求進行，各組細胞孵育時間宜為24h±2h。劃痕每孔細胞鋪板率應(yīng)達到90%～100%2（如圖1所示1mL磷酸鹽緩沖溶液進行拍照觀察。16孔板劃痕示意圖一次拍照43張照片，記錄初始劃痕面積。換液拍照結(jié)束應(yīng)棄掉磷酸鹽緩沖溶液，每孔更換為角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)液，細胞培養(yǎng)箱中孵育拍照結(jié)束應(yīng)棄掉磷酸鹽緩沖溶液，每孔更換為角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)液，細胞培養(yǎng)箱中孵育24h±2h。6.5二次拍照孵育結(jié)束按照6.3要求記錄24h劃痕面積。7數(shù)據(jù)分析圖片處理24h劃痕面積，圖片處理方法見附錄A。數(shù)據(jù)計算每組應(yīng)取3個復(fù)孔的平均值作為檢測結(jié)果，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）。計算公式見式（1）：Migrationrate(S0hS24h)/S0h100% (1)式中：Migrationrate——遷移率（%）；S0h——0h劃痕面積（cm2）；S24h——24h劃痕面積（cm2）。統(tǒng)計分析4數(shù)據(jù)應(yīng)使用t檢驗、雙尾檢驗分析顯著性差異。與空白對照組相比，p<0.05則認為其具有統(tǒng)計學(xué)差異。7.4精密度試驗中每組3（Coefficientof應(yīng)≤20%見式（2：(SD/Mean)100% (2)式中：C.V——變異系數(shù)(%)；SD——Mean——遷移率的平均值。8測試報告宜包括但不限于以下幾個方面的內(nèi)容：——目的；——材料；——設(shè)備；——方法；——數(shù)據(jù)與統(tǒng)計分析；——結(jié)果?！椒?；——數(shù)據(jù)與統(tǒng)計分析；——結(jié)果。9質(zhì)量保證24h70～80%。90%～100。與空白對照組相比，陽性對照組的遷移率提升且具有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）。5附錄A（資料性）以ImageJ圖像分析軟件為例，進行圖片處理方法的說明。圖片統(tǒng)一化處理劃痕面積計算使用ImageJ軟件進行劃痕面積的計算。導(dǎo)入要計算的圖片，執(zhí)行以下命令：Image-Type-8-bit黑白化處理；Process-Smooth畫面平滑；Process-Findedges增強邊緣顯示；Process-Filters-