專題突破10綜合PCR的基因工程問(wèn)題

一、選擇題

1.（2024.廈門高三質(zhì)檢）如圖表示PCR過(guò)程中某個(gè)階段反應(yīng)體系的情況，①②③④表示相關(guān)

物質(zhì)，L、R表示方向。下列敘述正確的是（）

"斑...

L5避33喳5'R

.......

A.②鏈從L到R的方向?yàn)?'-5',①②鏈均可作為子鏈合成的模板

B.PCR過(guò)程需要通過(guò)解旋酶斷開氫鍵，且為邊解旋邊復(fù)制

C.以1個(gè)DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)需消耗8個(gè)引物③

D.物質(zhì)③的5,端添加了某序列，至少需經(jīng)2次循環(huán)才可獲得該序列的雙鏈產(chǎn)物

2.（2024?重慶高三質(zhì)檢）不對(duì)稱PCR是利用不等量的一對(duì)引物來(lái)產(chǎn)生大量單鏈DNA（ssDNA）

的方法，如圖所示。不對(duì)稱PCR中加入的一對(duì)引物中含量較少的被稱為限制性引物，含量較

多的被稱為非限制性引物，兩者的比例通常為1：100,PCR反應(yīng)最初的若干次循環(huán)中，其擴(kuò)

增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA（dsDNA）,但當(dāng)限制性引物消耗完后，就會(huì)產(chǎn)生大量的ssDNA。下列

相關(guān)說(shuō)法錯(cuò)誤的是（）

甲F11111

也”限制性引物

甲^tlltlllll1

/r,___-_1___

A.用不對(duì)稱PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)，不需要知道基因的全部序列

B.進(jìn)行最初若干次循環(huán)的目的是增加模板DNA的量

C.最后大量獲得的ssDNA與圖中乙鏈的堿基序列一致

D.因?yàn)殡p鏈DNA和單鏈DNA的分子量大小不同，可通過(guò)電泳方法將其分離

3.（2024?無(wú)錫高三模擬）重疊延伸PCR可實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)基因誘變，其操作過(guò)程如圖所示（凸起處代

表突變位點(diǎn)）。下列說(shuō)法正確的是（）

通用引物FP1突變引物FP2

突變引物RP1I通用引物RP2

①3

第1對(duì)引物

公的PCR產(chǎn)物

第對(duì)引物

2重疊區(qū)域

的PCR產(chǎn)物

②混合、變性、復(fù)性

3'5'?3'

3,一X5'

③延伸

通用引物FP]

先

L通麗物RP2

PCR1④

突變的基因

A.過(guò)程①需要把兩對(duì)引物同時(shí)加入一個(gè)擴(kuò)增體系以提高擴(kuò)增效率

B.過(guò)程①需要2輪PCR才能得到圖中所示PCR產(chǎn)物

C.過(guò)程②的產(chǎn)物都可以完成延伸過(guò)程

D.若過(guò)程④得到16個(gè)突變基因則需要消耗15個(gè)通用引物RP2

4.反向PCR是一種通過(guò)已知序列設(shè)計(jì)引物對(duì)未知序列（圖中L、R）進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)，其過(guò)程

如圖所示。下列相關(guān)敘述不正確的是（）

,已知序列口

51L?尸，3,

酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)

,①酹切「

環(huán)化并加入根據(jù)已

知序列合成的引物

R

③PCR擴(kuò)增

L1R

「IIJ

已知序列已知序列

A.過(guò)程①用同一種限制酶對(duì)未知序列兩端進(jìn)行切割

B.過(guò)程②需要使用DNA連接酶，形成磷酸二酯鍵

C.過(guò)程③PCR體系需要添加耐高溫的DNA聚合酶和解旋酶

D.該技術(shù)可檢測(cè)T—DNA整合到植物染色體DNA的位置

5.IKK激酶參與動(dòng)物體內(nèi)免疫細(xì)胞的分化。臨床上發(fā)現(xiàn)某重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID）患兒的

的0基因編碼區(qū)第1183位堿基T突變?yōu)镃。為研究該患兒發(fā)病機(jī)制，研究人員應(yīng)用大引物

PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)獲得突變基因，如圖所示。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是（）

引物

/KK/3基因I11111

!!!!!!

PCR.-T—J-5f

引物山磯」

c.大引物a鏈

“大弓i物b鏈

G

/KK0基因

5'_____3Z

PCR2T?5'

引物C一一大引物a鏈

G大引物b鏈

SacI

G3

5'L——

c

Gindin

注：定點(diǎn)誘變獲得突變基因的過(guò)程，需要以下

3種引物：

引物A:5Z—CCCCAACCGGAAAGTGTCA—3r

、突變堿基

引物B:5y—TAAGCTTCGAACATCCTA—3Z

識(shí)別序列

引物C:5Z—GTGAGCTCGCTGCCCCAA—3(

SacI識(shí)別序列

A.PCRi中使用的引物有引物A、引物C

B.PCR2中使用的引物有引物3、大引物b鏈

C.PCRi過(guò)程需要擴(kuò)增3輪才能獲得目標(biāo)產(chǎn)物

D.PCR2過(guò)程中，為減少錯(cuò)誤DNA片段的產(chǎn)生可適當(dāng)升高復(fù)性溫度

6.（2024?安順高三調(diào)研）熒光定量PCR技術(shù)可定量檢測(cè)樣本中DNA含量，用于病毒檢測(cè)。其

原理是在PCR反應(yīng)體系中加入引物的同時(shí)，加入與某條模板鏈互補(bǔ)的熒光探針。當(dāng)耐高溫的

DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處會(huì)水解探針，使熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增

一次，就有一個(gè)熒光分子生成（如圖）。通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，可得Ct值（熒光信號(hào)達(dá)到

設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)）。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（）

熒光探針

A.PCR每個(gè)循環(huán)包括變性、復(fù)性（引物和模板結(jié)合）、延伸3個(gè)階段

B.耐高溫的DNA聚合酶在該反應(yīng)中的作用是形成磷酸二酯鍵

C.最終監(jiān)測(cè)的熒光強(qiáng)度與起始時(shí)反應(yīng)管內(nèi)樣本DNA的含量呈正相關(guān)

D.Ct值越大表示被檢測(cè)樣本中病毒數(shù)目越多，患者危險(xiǎn)性更高

7.（2024?襄陽(yáng)高三模擬）通過(guò)設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)目的基因的定點(diǎn)誘變。如圖

為基因工程中獲取突變基因的過(guò)程，其中引物1序列中含有一個(gè)堿基T不能與目的基因片段

配對(duì)，但不影響引物與模板鏈的整體配對(duì)，反應(yīng)體系中引物1和引物2的5,端分別設(shè)計(jì)增

加限制酶a和限制酶b的識(shí)別位點(diǎn)。下列有關(guān)敘述不正確的是（）

酶aT

弓I物］三______________

二7引物2

酶第1可PCR酶\

引物］_L^-----------------------

一3----------------------1■引物2

酶a普輪KR酶b

弓I物1」一二二〒二二2221^|物2

'!酶b

A.引物中設(shè)計(jì)兩種限制酶識(shí)別位點(diǎn)有利于目的基因定向插入

B.復(fù)性溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致引物不能與模板牢固結(jié)合，PCR擴(kuò)增效率下降

C.第3輪PCR,引物1能與圖中②結(jié)合并且形成兩條鏈等長(zhǎng)的突變基因

D.第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對(duì)且兩條鏈等長(zhǎng)的DNA占1/2

8.（2024?南通高三調(diào)研）如圖是被農(nóng)桿菌侵染的水稻植株的DNA片段，研究者將其連接成環(huán),

并以此環(huán)為模板進(jìn)行PCR,擴(kuò)增出T—DNA插入位置兩側(cè)的未知序列，據(jù)此來(lái)確定T—DNA

插入的具體位置。下列有關(guān)說(shuō)法錯(cuò)誤的是（）

未知序列引物①T-,DNA引物②未知序列

m弓一匚二乙二一?一玄多

限制st切點(diǎn)引物③引物④限制趟目點(diǎn)

A.農(nóng)桿菌在自然條件下主要侵染雙子葉植物和裸子植物，T-DNA存在于其Ti質(zhì)粒上

B.利用圖中的引物②③組合可擴(kuò)增出兩側(cè)的未知序列

C.若擴(kuò)增循環(huán)〃次，需要2#i—2個(gè)引物

D.將擴(kuò)增出的未知序列與水稻基因組序列比對(duì)可確定T—DNA的插入位置

9.實(shí)時(shí)熒光定量RT—PCR技術(shù)需要在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上添加熒光染料或熒光探針，熒光染料

能特異性摻入DNA雙鏈中，從而發(fā)出熒光信號(hào)。在流感流行季節(jié)，對(duì)懷疑流感病毒感染的

患者，可以通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT—PCR技術(shù)進(jìn)行核酸檢測(cè)。下列相關(guān)敘述不正確的是（）

針

i.熱變性獸譬熒光物質(zhì)點(diǎn)飛淬滅物質(zhì)

III1IIIIIIIIIIIIII1I

2.復(fù)性/探針與模板的雜交

聚食覽⑹探針雜交?

IIIIIQfIIIIIII

IIII[IIIIIIII1IIIIII

3.延伸反應(yīng)IIIIIIIIIII口f—9

IIIIIIIIIIIIIIIIIIII

A.圖中的探針可能是利用熒光分子標(biāo)記的流感病毒獨(dú)特的基因序列

B.核酸檢測(cè)是通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)確定樣本中是否有病毒核酸的

C.PCR技術(shù)利用了DNA雙鏈復(fù)制的原理，需要解旋酶和耐高溫的DNA聚合酶的催化

D.用熒光RT-PCR技術(shù)測(cè)定病毒的核酸具有特異性

二、非選擇題

10.(2023?江蘇，22節(jié)選)為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達(dá)，運(yùn)用重組酶技術(shù)

構(gòu)建質(zhì)粒，如圖1所示。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

擬構(gòu)建的720bp|390bp|

注：EGFP熒光蛋白

基因結(jié)構(gòu)EGFPAnBl

AnBl納米抗體。

喳土F2片段PCR引物

叱fFl片段NEE江門W1-及目的產(chǎn)

T7W3F2-R物片段

F1-R

D-一線性質(zhì)粒

基因重組A廿"y~

載體

克隆流程PCR產(chǎn)物片段與重組酶

線性載體混合0

注：一表示PCR引物；

相同背景方框表示

同源序列。

圖1

(1)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段F1與片段F2時(shí),配制的兩個(gè)反應(yīng)體系中不同的有,

擴(kuò)增程序中最主要的不同是o

(2)將PCR產(chǎn)物片段與線性質(zhì)粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，直接用于轉(zhuǎn)

化細(xì)菌。這一過(guò)程與傳統(tǒng)重組質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程相比，無(wú)需使用的酶主要有o

(3)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，下列敘述錯(cuò)誤的有=

A.稀釋涂布平板需控制每個(gè)平板30~300個(gè)菌落

B.抗性平板上未長(zhǎng)出菌落的原因一般是培養(yǎng)基溫度太高

C.抗性平板上常常會(huì)出現(xiàn)大量雜菌形成的菌落

D.抗性平板上長(zhǎng)出的單菌落無(wú)需進(jìn)一步劃線純化

(4)為了驗(yàn)證平板上菌落中的質(zhì)粒是否符合設(shè)計(jì)，用不同菌落的質(zhì)粒為模板、用引物Fl—F和

F2-R進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，質(zhì)粒Pl?P4的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2。根據(jù)圖中結(jié)果判斷，可

以舍棄的質(zhì)粒有。

圖2

⑸對(duì)于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒，通常需進(jìn)一步通過(guò)基因測(cè)序確認(rèn)，原因是

11.基因工程在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用發(fā)展迅速，我國(guó)轉(zhuǎn)基因作物的種植面積在世界有較高排名。

請(qǐng)回答下列相關(guān)問(wèn)題：

(1)目的基因的篩選與獲取是基因工程的第一步。為提高機(jī)會(huì)和可能，目的基因往往從相關(guān)的

_________________________的基因中進(jìn)行篩選O

(2)目的基因可以人工合成、從基因文庫(kù)中獲取，還可以利用PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增。如圖1

展示了PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增目的基因的原理，請(qǐng)分析回答下列問(wèn)題：

目的基因

圖1

①PCR技術(shù)利用了DNA半保留復(fù)制原理和原理。PCR的一次循環(huán)包括變性、

復(fù)性和延伸三個(gè)過(guò)程，復(fù)性的作用是______________________________________________

②將一個(gè)DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增，理論上目的基因最早在第.次循環(huán)后獲得；第5次循環(huán)

后，可擴(kuò)增得到.個(gè)目的基因。

(3)反向PCR可用于擴(kuò)增未知序列，其原理如圖所示。圖中鏈狀DNA分子內(nèi)側(cè)是已知序歹U，

外側(cè)為未知序列。請(qǐng)回答相關(guān)問(wèn)題:

圖3經(jīng)EcoR酶切后的DNA分子圖4環(huán)化后的DNA分子

①EcoRI酶切后得到的一AATT稱為黏性末端，“黏性”的含義是

EcoRI切割得到黏性末端的原因是___________________________________________

②不直接在圖2中DNA分子的兩端設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行擴(kuò)增，原因是o

③圖4中環(huán)狀DNA進(jìn)行PCR的過(guò)程中，沿引物A延伸子鏈的延伸方向是（填“順時(shí)

針”或“逆時(shí)針”），PCR產(chǎn)物（填“含有”或“不含"）瓦oRI的酶切位點(diǎn)。

12.（2024?湖北華中師大附中高三模擬）幽門螺桿菌是一種常見的人類致病菌，其骨架蛋白

MreB通過(guò)影響胭酶活性而參與調(diào)控其致病性。為了更準(zhǔn)確地分離出MreB蛋白，用重疊延伸

PCR技術(shù)（指在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈，通

過(guò)重疊鏈的延伸，將不同來(lái)源的片段重疊拼接起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)），將幽門螺桿菌M陽(yáng)8基因中

編碼終止密碼子前的DNA序列與TAP標(biāo)簽（可以標(biāo)記幽門螺桿菌基因組中任何一個(gè)基因，且

不會(huì)影響基因的表達(dá)）進(jìn)行連接，構(gòu)建了融合表達(dá)蛋白MreB和TAP標(biāo)簽的質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)流程如

圖所示。據(jù)圖回答下列問(wèn)題：

切物2引物4

MreB基因TAP標(biāo)簽

用引物1、引物2引物3,

引物1用引物3、引物4

進(jìn)行PCR1一進(jìn)行PCR2

---------<-------ot鏈

引物1引物2引物3引物4

B鏈

產(chǎn)物3-4

、變性后重疊延伸

a鏈

B鏈

PCR3EcoRI

基因TAP標(biāo)簽

帶有標(biāo)簽的基因

r'T)TScllTlI

EcoR1xhoI

Km%卡那霉素抗性基因

啟動(dòng)子pK18mob限制酶識(shí)別序列及切割位點(diǎn)：

SacB

EcoRIXhoISamIEcoRI

質(zhì)粒dTCGAGGGG^CCCG^AATTC

復(fù)制原點(diǎn)

（1）重疊PCR獲得帶有標(biāo)簽的MreB基因

①獲得兩種具有重疊片段DNA的過(guò)程中，PCR1和PCR2必須在不同的反應(yīng)體系中，原因是

②PCR3反應(yīng)體系中所加入的引物是o

（2）重組質(zhì)粒的構(gòu)建

①為將帶有標(biāo)簽的MreB基因定向插入到PK18mobSacB質(zhì)粒中，需要在引物末端添加限制酶

識(shí)別序列，據(jù)圖分析，在引物1添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是,在引物4

添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是0經(jīng)過(guò)這兩種酶酶切的帶有標(biāo)簽的MreB基因

u

和PK18mobSacB質(zhì)粒進(jìn)行連接時(shí)，可選用（填E.coliDNA連接

酶”或“T4DNA連接酶”）。

②重組質(zhì)粒中，K”產(chǎn)基因的作用是

專題突破10綜合PCR的基因工程問(wèn)題

1.D

2.C［不對(duì)稱PCR中加入的一對(duì)引物中含量較多的被稱為非限制性引物，非限制性引物是

與乙鏈結(jié)合，最后大量獲得的ssDNA與圖中甲鏈的堿基序列一致，C錯(cuò)誤。］

3.D［兩種突變引物能互補(bǔ)配對(duì)，因此過(guò)程①必須分兩個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行，A錯(cuò)誤；過(guò)程①

至少需要3輪PCR才能得到圖中所示PCR產(chǎn)物，B錯(cuò)誤；過(guò)程②獲得的產(chǎn)物不都可以完成

延伸過(guò)程，因?yàn)樽渔溨荒軓囊锏?'端開始延伸，C錯(cuò)誤；若過(guò)程④得到16個(gè)突變基因，

由于模板中不含有通用引物，則產(chǎn)生16個(gè)突變基因共需要消耗16X2—2=30（個(gè)）通用引物，

而需要通用引物RP2的數(shù)量為30+2=15（個(gè)），D正確。］

4.C［過(guò)程③即PCR擴(kuò)增，PCR技術(shù)中DNA解旋是在高溫下實(shí)現(xiàn)的，不需要加入解旋酶，

C錯(cuò)誤。］

5.C［在PCRi中，需要兩種引物，將來(lái)在切取/K跖基因時(shí)，在基因的左側(cè)需要用限制酶

H加dill來(lái)切割，在基因的右側(cè)用限制酶SacI切割，因此在PCRi中結(jié)合到基因右端的引物

選擇引物C,從題圖中看，另一個(gè)引物應(yīng)含有突變堿基C,所以選擇引物A,A正確；在PCR2

中，有一個(gè)引物結(jié)合到了基因的左端，應(yīng)含有限制酶III識(shí)別的序列，所以要用到引物8,

而另外的一個(gè)引物就是大引物中的一條鏈，它應(yīng)該結(jié)合到基因的右端，且從5'端到3'端的

序列中開始部位應(yīng)含有SacI識(shí)別的序列，從圖中看，它是大引物的b鏈，B正確；PCR,

過(guò)程主要是為了獲得大引物，則擴(kuò)增2輪即可獲得目標(biāo)產(chǎn)物，C錯(cuò)誤；由于大引物較長(zhǎng)，含

C與G的堿基較多，為減少非目的基因的獲得，在PCR?復(fù)性過(guò)程中應(yīng)適當(dāng)提高溫度，便于

引物與模板鏈的結(jié)合，D正確。］

6.D［Ct值越小，說(shuō)明所需循環(huán)的次數(shù)越少，被檢測(cè)樣本中病毒數(shù)目越多，D錯(cuò)誤。］

7.D

8.B［農(nóng)桿菌在自然條件下主要侵染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染

能力，A正確；耐高溫的DNA聚合酶可在引物的3,端延伸子鏈，因此利用圖中的引物①④

組合可擴(kuò)增出兩側(cè)的未知序列，B錯(cuò)誤；擴(kuò)增循環(huán)〃次，得到2〃個(gè)DNA分子，總單鏈數(shù)為

2X2"即2"+i條，只有最初的2條母鏈不需要引物，因此共需要2.|一2個(gè)引物，C正確；不

同的DNA分子或DNA區(qū)段具有特異性，將擴(kuò)增出的未知序列與水稻基因組序列比對(duì)可確定

T—DNA的插入位置，D正確。］

9.C