1T/GDPMAAXXXX—2024缺血性腦卒中動物模型評價技術(shù)規(guī)范第2部分：非人靈長類動物本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了非人靈長類缺血性腦卒中模型制備的動物質(zhì)量和飼養(yǎng)要求、制備方法、評價方法和結(jié)果判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于非人靈長類缺血性模型的制備及應(yīng)用評價。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB14922.1實驗動物寄生蟲學(xué)等級及檢測GB14922.2實驗動物微生物學(xué)等級及監(jiān)測GB/T14924.2實驗動物配合飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB14924.3實驗動物配合飼料營養(yǎng)成分GB14925實驗動物環(huán)境及設(shè)施T/CALAS104實驗動物實驗猴神經(jīng)行為評價規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1缺血性腦卒中cerebralischemicstroke是指各種原因?qū)е碌哪X組織血液供應(yīng)障礙，并由此產(chǎn)生的缺血缺氧性壞死，進(jìn)而出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙的一類臨床綜合征。3.2神經(jīng)功能評價量表neurologicalfunctionassessmentscale用于評估動物模型神經(jīng)功能缺損程度和恢復(fù)情況的工具，評價內(nèi)容包括意識水平、感覺系統(tǒng)、運動系統(tǒng)和骨骼肌協(xié)調(diào)等。3.3運動能力評價motorfunctionassessment利用不同動物運動評價設(shè)備，如步態(tài)分析系統(tǒng)等，觀察動物在不同情境下的運動行為變化，用于測試和評價動物的運動能力。3.4延遲記憶評價long-termmemoryassessment利用動物認(rèn)知測試設(shè)備，如威斯康辛通用測試裝置等，觀察動物辨別物體能力以及對刺激信號的反應(yīng)，用于測試和評價動物的工作記憶行為學(xué)變化。3.5核磁共振成像magneticResonanceImaging（MRI）利用原子核在磁場中產(chǎn)生的磁共振信號來生成動物組織器官內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化的圖像。4動物質(zhì)量及飼養(yǎng)要求2T/GDPMAAXXXX—20244.1非人靈長類質(zhì)量應(yīng)符合GB14922的要求。4.2飼養(yǎng)環(huán)境應(yīng)符合GB14925的要求。4.3飼料應(yīng)符合GB/T14924.2和GB14924.3的要求。5動物模型制備方法非人靈長類缺血性卒中模型制備方法通常包括電凝法、栓塞法和光化學(xué)法等。5.1電凝法非人靈長類動物缺血性腦卒中模型構(gòu)建的常用方法，手術(shù)操作簡單。通過電凝器永久性阻斷實驗猴的大腦中動脈（MCA），造成腦缺血損傷。具體方法如下：1)術(shù)前準(zhǔn)備。非人靈長類動物術(shù)前禁食12小時，自由飲水。進(jìn)行麻醉、備皮、消毒等準(zhǔn)備工作。2)麻醉。術(shù)前注射麻醉劑進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，術(shù)中采用呼吸麻醉機進(jìn)行維持麻醉，手術(shù)過程中保溫。3)手術(shù)。非人靈長類動物側(cè)放固定在手術(shù)臺上，頭固定于立體定位儀上。通過開顱手術(shù)暴露大腦中動脈（MCA）。使用電凝器對MCA進(jìn)行電凝處理，阻斷其血流，造成腦缺血損傷。電凝的位置和程度需要根據(jù)實驗需求進(jìn)行精確控制。動物蘇醒后，放入飼養(yǎng)籠中進(jìn)行護(hù)4)術(shù)后護(hù)理。術(shù)后動物比較虛弱，需注射抗生素3-5天，給予流質(zhì)食物。必要時注射甘露醇降低顱內(nèi)壓，減少動物死亡。術(shù)后6小時后可通過MRI掃描確定腦梗死情況。5.2栓塞法非人靈長類動物缺血再灌注模型構(gòu)建的常用方法。利用X射線成像設(shè)備或DSA的精確成像能力，結(jié)合微導(dǎo)管技術(shù)，將栓塞材料精準(zhǔn)地送入目標(biāo)血管（如大腦中動脈從而實現(xiàn)血管的閉塞。具體方法如下：1)術(shù)前準(zhǔn)備。非人靈長類動物術(shù)前禁食12小時，自由飲水。進(jìn)行麻醉、備皮、消毒等準(zhǔn)備工作。2)麻醉。術(shù)前注射麻醉劑進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，術(shù)中采用呼吸麻醉機進(jìn)行維持麻醉，手術(shù)過程中需保溫。3)手術(shù)。非人靈長類動物仰臥固定在手術(shù)臺上，通過X射線成像設(shè)備或DSA對腦血管進(jìn)行造影檢查，明確大腦中動脈的位置、形態(tài)及血流情況。根據(jù)動物血管大小選擇合適的導(dǎo)管，在X射線成像設(shè)備或DSA的引導(dǎo)下，將微導(dǎo)管經(jīng)股動脈穿刺置入，并引導(dǎo)至大腦中動脈的預(yù)定位置。通過微導(dǎo)管向大腦中動脈注入栓塞材料（如自體血栓凝塊、彈簧圈、球囊等），觀察成像圖像以確認(rèn)栓塞效果。缺血60分鐘后撤除球囊、彈簧等實現(xiàn)再灌注模型制備。手術(shù)過程中去除部分顱瓣降低顱內(nèi)壓，減少動物死亡。4)術(shù)后護(hù)理。術(shù)后動物比較虛弱，需注射抗生素3-5天，給予流質(zhì)食物。必要時注射甘露醇降低顱內(nèi)壓，減少動物死亡。術(shù)后6小時后可通過MRI掃描確定腦梗死情況。5.3光化學(xué)法非人靈長類缺血性腦卒中模型構(gòu)建的常用方法，創(chuàng)傷面小，可精準(zhǔn)定位。利用光敏劑（如玫瑰紅）在特定強度光照下發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，在大腦的照射局部產(chǎn)生腦水腫和血小板微血栓，進(jìn)而形成局灶性腦梗死。具體方法如下：1)術(shù)前準(zhǔn)備。非人靈長類動物術(shù)前禁食12小時，自由飲水。進(jìn)行麻醉、備皮、消毒等準(zhǔn)備工作。2)麻醉。術(shù)前注射麻醉劑進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，術(shù)中采用呼吸麻醉機進(jìn)行維持麻醉，手術(shù)過程中需保溫。3)手術(shù)。選定大腦中動脈遠(yuǎn)端或其他需要模擬卒中的腦區(qū)作為照射部位，插入光纖，靜脈注射玫瑰紅（35mg/KG）3分鐘，使用激光（15mW）光源對選定的部位進(jìn)行連續(xù)照射30分鐘，移去光源，縫合骨膜、皮膚。3T/GDPMAAXXXX—20244)術(shù)后護(hù)理。術(shù)后動物需注射抗生素3-5天，給予流質(zhì)食物。必要時注射甘露醇降低顱內(nèi)壓，減少動物死亡。術(shù)后6小時后可通過MRI掃描確定腦梗死情況。6評價方法6.1腦損傷磁共振掃描評價6.1.1非人靈長類腦缺血性卒中模型可分為4期，超急性期（0-6小時），急性期（6-72小時），亞急性期（3-10天），慢性期（10天以后）。6.1.2檢測檢測腦水腫變化可采用彌散加權(quán)成像（Diffusionweightedimaging，DWI）。6.1.3檢測腦梗死損傷變化可采用掃描T1加權(quán)成像（T1weightedimaging,T2WI）和T2加權(quán)成像（T2weightedimaging,T2WI）。腦梗死體積測定采用磁共振掃描獲得T2WI圖像，在每個腦冠狀切片上圈選出腦梗死灶邊界及對側(cè)正常半腦邊界，利用ImageJ軟件計算梗死面積，將所有切面梗死灶面積和對側(cè)正常半腦面積相加后乘以切片厚度，得到梗死灶體積及對側(cè)正常半腦體積。腦梗死體積比（%）=（患側(cè)半腦梗死組織體積÷對側(cè)正常半腦體積）×100%。6.2神經(jīng)功能評價參照T/CALAS104中6.1和7.1進(jìn)行。6.3運動功能評價6.3.1利用步態(tài)分析設(shè)備評價動物四肢行走及協(xié)調(diào)能力。實驗應(yīng)在獨立安靜的環(huán)境中開展，測試前動物需禁食。造模前對動物進(jìn)行訓(xùn)練，確保動物在勻速運動的跑步機上正常行走。造模后動物可以正常飲食和運動后，連續(xù)3天對動物進(jìn)行步態(tài)視頻錄制，錄制時長不少于10s。利用運動軌跡分析軟件，對錄制視頻中動物各個標(biāo)記關(guān)節(jié)進(jìn)行分析，獲得動物行走過程中的步頻、步幅、步長、步間隔等數(shù)據(jù)，評價動物的運動功能。6.3.2運動感知行為評價參照T/CALAS104中6.4和7.4進(jìn)行。6.4延遲記憶評價參照T/CALAS104中6.2和7.2進(jìn)行。6.5組織病理診斷動物安樂死后，對腦組織進(jìn)行灌注固定，分離腦組織，在4%多聚甲醛中進(jìn)行固定保存，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋制成蠟塊，切成4μm厚度切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅或尼氏染色并封片。組織切片應(yīng)包含梗死灶及周邊半暗帶組織，觀察梗死灶和半暗帶組織神經(jīng)元壞死及炎癥細(xì)胞活化情況。7結(jié)果判定7.1磁共振成像病變特征1)超急性期在梗死區(qū)域DWI可顯示明顯的高信號，病變區(qū)表現(xiàn)為腦回部腫脹、腦溝部變淺、灰白質(zhì)界限不清晰。2)急性期T1WI呈低信號、T2WI呈高信號、DWI高信號，腦室由于受壓會出現(xiàn)變形、移位，中線結(jié)構(gòu)向?qū)?cè)移位，表現(xiàn)為局部的腦溝和腦裂消失。3)亞急性期表現(xiàn)T1WI低信號、T2WI高信號、梗死區(qū)DWI低信號。增強掃描可出現(xiàn)腦回狀強化，顯影逐漸變淡。4)慢性期病灶逐漸液化，周邊膠質(zhì)增生帶呈高信號、DWI呈低信號。梗死區(qū)域局灶性腦萎縮，形成軟化灶，類似于腦脊液的信號。7.2腦梗死體積磁共振成像計算動物腦梗死體積比，評價造模后梗死體積大小。4T/GDPMAAXXXX—20247.3神經(jīng)功能神經(jīng)功能評分由意識水平（0-28分），感覺系統(tǒng)（0-22分），運動系統(tǒng)（0-32分），骨骼肌協(xié)調(diào)性（0-18分）組成，總分越高表明神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。7.4運動功能7.4.1利用步態(tài)分析設(shè)備進(jìn)行步態(tài)評價，連續(xù)3天評價的平均數(shù)作為實驗結(jié)果，造模后的各肢體采集數(shù)據(jù)與造模前相比出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)上的顯著性差異時可判定動物出現(xiàn)四肢行走及協(xié)調(diào)功能損傷。7.4.2利用山和谷階梯任務(wù)裝置開展運動感知行為評價，連續(xù)5天評價的平均分?jǐn)?shù)作為實驗結(jié)果，造模后的分?jǐn)?shù)與造模前相比出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)上的顯著性降低時可