分子標(biāo)記技術(shù)及其在植物中的應(yīng)用周軍

教授一、分子標(biāo)記概述標(biāo)記:標(biāo)志，記號(hào)。遺傳標(biāo)記:具有遺傳特性的標(biāo)記。遺傳標(biāo)記:基因型的特殊的易于識(shí)別的表現(xiàn)形式。其最基本的兩個(gè)特性是:可遺傳性?？勺R(shí)別性（多態(tài)性）。遺傳標(biāo)記是研究遺傳現(xiàn)象和物種進(jìn)化的不可缺少的工具。遺傳標(biāo)記的主要種類形態(tài)學(xué)標(biāo)記；細(xì)胞學(xué)標(biāo)記；生化標(biāo)記；分子標(biāo)記（建立在某些大分子物質(zhì)多態(tài)性基礎(chǔ)上的一類遺傳標(biāo)記）。狹義上,僅指以DNA為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記。廣義上,還包括同工酶（等位酶）。DNA分子標(biāo)記:是一種小的DNA片段，其分子量通常只有幾十～幾千bp（堿基對(duì)），相對(duì)于龐大的基因組（幾億～幾十億bp）而言，實(shí)在是很微?。ㄐ∮行〉暮锰帲?。多數(shù)情況下，DNA分子標(biāo)記并不是基因或基因的一部分，而是與基因有連鎖關(guān)系的一個(gè)小片段。是否具有兩個(gè)基本特性:可遺傳性；可識(shí)別性（有難度，需要較高的技術(shù)）。改善可識(shí)別性的思路與方法:提高檢測(cè)技術(shù)的靈敏度（同位素，EB染色、銀染等）；加大DNA的絕對(duì)量（PCR擴(kuò)增，大量提?。?；上述兩者結(jié)合使用。DNA分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn):位點(diǎn)數(shù)目相當(dāng)多，基本上能滿足研究之需；直接檢測(cè)DNA，無(wú)需等待基因的表達(dá)，也不受環(huán)境條件的影響；多為中性突變（因?yàn)樗话悴粚儆诨颍?；多為共顯性遺傳。常用的DNA分子標(biāo)記種類:RFLP（限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）:利用限制性內(nèi)切酶對(duì)核苷酸序列的識(shí)別作用，將基因組DNA切割成不同長(zhǎng)度的片段，通過(guò)電泳分離、分子雜交及顯影技術(shù)（同位素或非同位素），把材料間DNA的差異揭示出來(lái)。材料間DNA的差異，來(lái)自于限制性酶切位點(diǎn)的變異（增加或減少），使切割產(chǎn)物（片段）的長(zhǎng)度發(fā)生變化（變短或變長(zhǎng)），最終產(chǎn)生多態(tài)性。技術(shù)關(guān)鍵:所用的限制性內(nèi)切酶能否恰好識(shí)別特定的位點(diǎn)（變異位點(diǎn)）。模板酶切前模板酶切后分子雜交及放射性自顯影之后出現(xiàn)的多態(tài)性RFLP可轉(zhuǎn)化為次級(jí)標(biāo)記,如酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS)或序列標(biāo)記位點(diǎn)（STS）,是指將能產(chǎn)生多態(tài)性的RFLP探針的兩端測(cè)序,合成引物對(duì)基因組進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物為基因組中與探針同源的DNA片段,由于這樣的擴(kuò)增片段一般較少表現(xiàn)多態(tài)性,還需要用多種內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物,以期獲得擴(kuò)增片段內(nèi)存在的多態(tài)性。由于只有擴(kuò)增片段長(zhǎng)度內(nèi)（即探針片段長(zhǎng)度內(nèi)）存在的多態(tài)性才有可能被檢測(cè)到,這種方法所檢測(cè)的的多態(tài)性水平較低。ALP（擴(kuò)增子長(zhǎng)度多態(tài)性）RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA),AP-PCR(隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增)和DAF(DNA擴(kuò)增指紋分析)相似,都是以隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ),它們合稱為ALP。RAPD和AP-PCR分別由Williams等（1990）及Welsh等（1990）于1990年提出,被分別用于遺傳作圖和基因組指紋分析。但兩者其實(shí)是類似的方法。與一般的PCR擴(kuò)增相比,RAPD和AP-PCR采用隨機(jī)設(shè)計(jì)的單個(gè)引物,常用的引物為10個(gè)核苷酸的DNA序列,擴(kuò)增時(shí)退火溫度降低至35℃左右,以利于引物與模板結(jié)合。DAF則是由Caetano-Annoles等人（1991）于1991年建立的,所用的引物更短（5-8個(gè)核苷酸）,擴(kuò)增產(chǎn)物以聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后銀染觀察,DAF可產(chǎn)生更多的DNA擴(kuò)增片段,單個(gè)反應(yīng)能獲得較多的信息。這三種標(biāo)記都呈顯性遺傳。模板DNARAPD電泳譜帶引物的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目多少及其在基因組中的分布情況,是RAPD分析的關(guān)鍵所在。RAPD分析的最佳片段大小為400～2000bp。RAPD標(biāo)記也可轉(zhuǎn)化為次級(jí)標(biāo)記,稱為序列特異性擴(kuò)增區(qū)（SCAR）,是指在RAPD分析中獲得多態(tài)性DNA片段以后,對(duì)其兩端測(cè)序,根據(jù)所測(cè)DNA序列,重新設(shè)計(jì)雙引物進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增,用以提高檢測(cè)的可靠性和穩(wěn)定性。SCAR在不同個(gè)體之間可能表現(xiàn)為存在／缺失,為顯性標(biāo)記,也可能表現(xiàn)為擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的差異,為共顯性標(biāo)記。AFLP(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)AFLP是RFLP和RAPD兩項(xiàng)技術(shù)的結(jié)合，它是荷蘭科學(xué)家Zabeau和Vos（1993）發(fā)明的一種標(biāo)記技術(shù)，已在美國(guó)申請(qǐng)了專利。先將DNA用限制性內(nèi)切酶降解，然后連上一個(gè)接頭，根據(jù)接頭和酶切位點(diǎn)的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，即:引物＝接頭＋酶切位點(diǎn)＋2～3個(gè)選擇性核苷酸，對(duì)基因組限制性酶切片段進(jìn)行選擇性PCR擴(kuò)增。AFLP標(biāo)記所檢測(cè)的多態(tài)性是酶切位點(diǎn)的變化或酶切片段內(nèi)DNA序列的插入或缺失，本質(zhì)上與RFLP技術(shù)相同，但操作簡(jiǎn)單得多。模板DNAAFLP指紋圖AFLP分析的最佳片段大小為200～500bp。選擇性核苷酸數(shù)目一般為3個(gè),能夠檢測(cè)限制性片段總數(shù)的1/4076。SSR（簡(jiǎn)單重復(fù)序列）也稱微衛(wèi)星或短串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性（STRP）。它是基因組中二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù),由于重復(fù)次數(shù)的不同而產(chǎn)生DNA片段長(zhǎng)度的多態(tài)性。其檢測(cè)采用PCR擴(kuò)增。與RFLP相比,微衛(wèi)星DNA在基因組中非常豐富,分布也比較均勻,多態(tài)性水平高,是一種較理想的分子標(biāo)記,但該類標(biāo)記的物種特異性強(qiáng),工作量大,費(fèi)用高。SSR其它:SNP（單核苷酸多態(tài)性）:單核苷酸的變異廣泛存在，可通過(guò)特別的方法進(jìn)行檢測(cè)（測(cè)序或熒光法）。SSCP（單鏈構(gòu)型多態(tài)性）:對(duì)RFLP標(biāo)記設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，熱變性成單鏈再?gòu)?fù)性，由于單鏈內(nèi)核苷酸順序的差異，有的可復(fù)性為雙鏈，有的則形成鏈內(nèi)氫健，可通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。RAMP(RandomAmplifiedMicrosatellitePolymorphism)。SRAP,STMS,ESTP,CAPS,RGHP,SAMPL,MITES等。二、分子標(biāo)記的應(yīng)用品種鑒別用分子標(biāo)記鑒別果樹(shù)品種具有十分重要的意義。雖然報(bào)道的果樹(shù)品種數(shù)量很多（如葡萄為14000個(gè)以上）,但其中可能存在不少同物異名或同名異物情況,需要糾正。利用分子標(biāo)記鑒別同物異名的情況最為有效,因?yàn)樗皇墉h(huán)境條件的影響。其次,在眾多的果樹(shù)無(wú)性系中,系間尤其是芽變系品種間的差異往往不是十分明顯,給品種區(qū)分帶來(lái)困難。通過(guò)分子標(biāo)記辨別就相對(duì)容易,因?yàn)榉肿訕?biāo)記的長(zhǎng)處,就是能檢測(cè)遺傳物質(zhì)的細(xì)微差異。目前用DNA標(biāo)記進(jìn)行品種鑒別或分類研究的果樹(shù)種有蘋果、梨、桃、柑橘、葡萄、草莓、油橄欖、番荔枝、番木瓜、芒果、懸鉤子、烏飯樹(shù)、酸果蔓及桑樹(shù)等,涉及的分子標(biāo)記種類也相當(dāng)齊全。異名品種鑒別芽變品系鑒別遺傳多樣性檢測(cè)與品種分類DNA序列的改變,是導(dǎo)致生物演化的最基本的元素,因此,通過(guò)DNA分子標(biāo)記研究,更能揭示個(gè)體間的差異及物種間的相關(guān)性,這些知識(shí)對(duì)利用野生種質(zhì)資源改良栽培品種也十分有用。在果樹(shù)上,這方面的研究已成為一個(gè)熱點(diǎn),涉及的樹(shù)種非常之多。已證實(shí)寬皮柑橘類、果梅和油橄欖品種間具有高度的遺傳多樣性,而桃和草莓的卻比較低。遺傳多樣性水平的高低直接取決于樣本的數(shù)量和來(lái)源地。利用數(shù)字分類學(xué)軟件,可以很方便地進(jìn)行聚類分析和分類研究,得到樹(shù)狀圖。常用的軟件有NTSYS-pc,Popgene（/）和SAS（SASInstituteInc）等,前兩者的效果更好。類研究—RAPD分析分類研究—樹(shù)狀圖遺傳多樣性和聚類分析的結(jié)果,還能指導(dǎo)雜交親本的選擇選配工作,并可用于預(yù)測(cè)后代的雜種優(yōu)勢(shì)。系譜分析果樹(shù)存在著大量的自然雜種類型,一些著名的栽培品種,最初也是由自然雜交籽苗繁衍而來(lái),有些品種則是實(shí)生選種或采用混合花粉雜交選育而成的,其系譜關(guān)系很模糊。DNA分子標(biāo)記為這一問(wèn)題的解決提供了有力的工具。有關(guān)的研究已證明,檸檬可能起源于枸櫞、溫州蜜柑應(yīng)起源于中國(guó)的本地早（而非日本立花橘）,蘋果上,兩個(gè)三倍體品種品種“喬納金”（金冠×紅玉）和“陸奧”（金冠×印度）,都是由母本金冠提供了未減數(shù)的配子,日本蘋果品種“津輕”的父本為“紅玉”,新西蘭的主栽品種“Braeburn”的親本為“LadyHamilton”。父本系譜關(guān)系的鑒別利用父本的顯性標(biāo)記鑒別父本系譜；利用母本的顯性標(biāo)記或細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記鑒別母本系譜。狀圖中的系譜關(guān)系構(gòu)建分子遺傳圖譜可為目標(biāo)基因的定位及克隆奠定基礎(chǔ)（圖位克?。?；利用連鎖關(guān)系,可對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行預(yù)選,預(yù)選工作可在幼苗期即完成；利用連鎖關(guān)系,可進(jìn)行基因聚合育種,定向地改良品種（不斷加強(qiáng)某個(gè)經(jīng)濟(jì)性狀）；對(duì)質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀都適用。f

mM04離位點(diǎn)的獲得連鎖圖譜構(gòu)建連鎖群之一目前，應(yīng)用RAPD.RFLP及同工酶等標(biāo)記，已構(gòu)建了蘋果、桃、扁桃、柑橘、葡萄、甜櫻桃、尖苞片蕉（香蕉的原始種之一，為二倍體）、番木瓜、核桃和越橘（烏飯樹(shù)）的分子連鎖圖，而其中單獨(dú)應(yīng)用RAPD標(biāo)記或以RAPD標(biāo)記為主進(jìn)行圖譜構(gòu)建的樹(shù)種就有柑橘、蘋果、桃、葡萄、甜櫻桃、二倍體蕉、番木瓜和越橘8個(gè)種類，所用的作圖群體為F1、BC1、F2和花粉培養(yǎng)群體。加上荔枝，共有11種果樹(shù)?；驑?biāo)記、定位與輔助選擇在許多情況下,果樹(shù)品種的改良,只需針對(duì)個(gè)別性狀進(jìn)行,因此,只要找到與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記,即可用于早期選擇。在這方面,Michelmore等（1991）建立的基于RAPD技術(shù)的集團(tuán)分離分析法（BSA）提供了有力的工具,該方法的通常做法是,針對(duì)某一性狀（如抗病性）,將分離群體的單株分成兩個(gè)集團(tuán)（抗病集團(tuán)和感病集團(tuán)）,對(duì)其進(jìn)行DNA多態(tài)性分析（常用RAPD）,尋找多態(tài)性片段。從理論上說(shuō),這兩個(gè)集團(tuán)的DNA應(yīng)是基本一樣的,如果其間的確存在DNA的差異,那么這種差異（即多態(tài)性DNA片段）就很可能與控制該性狀（抗病性）的基因座位連鎖,可以用于輔助選擇。Cheng等在Rome

Beauty

x

White

Angle的分離群體中進(jìn)行研究,從350個(gè)隨機(jī)引物中選出一個(gè)引物

BC226(5’GGGCCTCTAT3’),可在兩個(gè)池(紅色池和黃色池)間擴(kuò)增出不同的片段。在群體上的進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)片段與紅色性狀相關(guān),另外兩個(gè)片段與黃色性狀有關(guān)。設(shè)計(jì)合成一對(duì)通用引物來(lái)擴(kuò)增這些片段,不同的擴(kuò)增片段與果實(shí)顏色表現(xiàn)共分離,片段A1(1160

bp)與

Rome

Beauty、A2

(1180

bp)與White

Angle的紅色性狀連鎖,a1

(1230

bp)與黃色性狀相連鎖。后代同時(shí)具有A1和A2或其中之一,則表現(xiàn)紅色。在另外的3個(gè)雜交組合中,A與紅色性狀共分離,a1

和a2

(1320

bp)與黃色性狀相關(guān)。集團(tuán)分離分析在果樹(shù)基因定位方面已被廣泛應(yīng)用,目前果樹(shù)上已標(biāo)記的基因包括抗性基因、經(jīng)濟(jì)性狀基因以及QTL基因幾個(gè)類別。如蘋果抗黑星病Vf基因,柑橘抗柑橘衰退?。–TV）基因,蘋果抗疫霉病基因,桃抗白粉病基因,葡萄抗黑痘病及抗霜霉病基因等。經(jīng)濟(jì)性狀方面,已被標(biāo)記并用于輔助選擇的基因座位有蘋果果皮顏色,桃的經(jīng)濟(jì)性狀（8個(gè)質(zhì)量性狀）,荔枝的成熟期、焦核性,葡萄的無(wú)籽性狀、皮色及育性等。雜種、體細(xì)胞雜種、突變體、珠心苗與合子苗的鑒定根據(jù)父本的特征帶可以鑒定其后代是否為真正的雜種,具有多方面的用途。分子標(biāo)記對(duì)體細(xì)胞雜種的鑒別也非常有效,在柑橘類上有較多的成功經(jīng)驗(yàn)。突變體是基因組個(gè)別或少數(shù)位點(diǎn)發(fā)生突變的結(jié)果,由于一個(gè)引物僅能檢測(cè)基因組的極小部分,因而突變體的檢測(cè)比較困難,需采用大量的引物才可能獲得成功。突變體的鑒別在櫻桃、桃和荔枝上有成功的報(bào)道。荔枝焦核突變體的鑒定其它方面,如鑒別蘋果品種的芽變植株與實(shí)生苗植株,蘋果屬的顯性矮化主基因、元帥系蘋果的短枝型芽變,蘋果的柱形株型基因,以及柑橘的合子苗與珠心苗等,都有成功的報(bào)道。由此看來(lái),分子標(biāo)記在物種起源與進(jìn)化,品種分類與雜種鑒定等方面都有廣闊