DB32DetectionmethodforVibrioparahaemolyticusinaquaticbyreal-timefluorescrecombinase-aidamplificat江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布I市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院、廣東省科學(xué)院微生物研究所、杭州傲敏生物1水產(chǎn)品中副溶血性弧菌檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光重組酶介導(dǎo)本文件規(guī)定了水產(chǎn)品中副溶血性弧菌檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增（recombinase-aidAmplification，RAA）法的試劑材料、儀器設(shè)備、檢測(cè)程序、操作步驟、結(jié)果判定和報(bào)告、檢出限及防止污染措施。GB4789.7食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)副溶血性弧GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增recombinase-aidAmplific37℃~42℃),進(jìn)行核酸擴(kuò)增的技術(shù)。RAA法利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶代替了傳統(tǒng)PCR的熱循環(huán)解鏈過(guò)程。根據(jù)副溶血性弧除另有規(guī)定外，試劑為分析純或生化試劑，實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T6682的要求。所有試劑均用無(wú)DNA2根據(jù)副溶血性弧菌的特異性基因序列設(shè)計(jì)探TTAGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACAGATGTTGCCTGTATCAGACAAGCTGTCACCTTACGTTCTTCGCCGCTGACAATCGCTTC[FAM-dT]A[BHQ-dT]ACAACCACACGAa)熒光檢測(cè)儀：帶有恒溫（39℃±1℃)擴(kuò)增功能的熒光檢測(cè)儀。100μL～1000μL，并配備與移液器匹配的吸頭。副溶血性弧菌實(shí)時(shí)熒光RAA檢測(cè)程序見(jiàn)圖1。3陰性陽(yáng)性8.3實(shí)時(shí)熒光RAA擴(kuò)增4體積(μL）12.5μL2.1μL2.1μL0.6μL4.0μL26.2μL2.5μL50μL（2）將除MgAc2和模板DNA以外的所有成分渦旋混勻，分裝混合液至含有凍干酶制劑的200μL反應(yīng)管中，輕柔手彈使凍干粉充分重溶均勻，短暫離心，打開(kāi)反應(yīng)單元，向每個(gè)反應(yīng)），將反應(yīng)管置于熒光檢測(cè)儀中，39℃恒溫，30min。在反應(yīng)過(guò)程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)。檢測(cè)過(guò)程中分別設(shè)陰性對(duì)照、空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照?？瞻讓?duì)照以無(wú)菌水替代模板DNA；陰性對(duì)照以非副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA作為模板DNA；陽(yáng)性對(duì)照以副溶血性空白對(duì)照在30min內(nèi)無(wú)擴(kuò)增曲線；陰性對(duì)照在30min內(nèi)無(wú)擴(kuò)增曲線；陽(yáng)性對(duì)照在10min內(nèi)出現(xiàn)典型確證