備案號(hào)：DB32TestingregulationsofWeedyRiceinCultivatedRice’sSeed江蘇省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I 1 1 1 2 2 3 61栽培稻種中雜草稻檢測(cè)規(guī)程凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）GB/T22505糧油檢驗(yàn)感官檢驗(yàn)雜草稻(weedyrice)是指在水純合體的雜草稻homozygotic雜草稻的花粉飄逸到栽培稻柱頭上發(fā)生雜交，產(chǎn)生的栽培稻種子（2n=24稻的一半染色體（n=12條染色體），但果皮色依然表現(xiàn)為白色。稱為雜草稻雜合體。其種植到田里開花結(jié)果，就會(huì)產(chǎn)生性狀分離，產(chǎn)生具有紅色果皮的雜草Rc基因是水稻果皮原花色素積累途徑中最重要的調(diào)節(jié)基因之一,位于第7染色體上,全長(zhǎng)約6.4kb,包含有8個(gè)外顯子,產(chǎn)物為一個(gè)具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)元件的調(diào)節(jié)蛋白。Rc基因具有比rc基因多14bp插入/缺失，從而設(shè)計(jì)特異性14bp插入/缺失引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增24檢測(cè)前準(zhǔn)備工作4.1試劑配制）：），4.2儀器和用具4.3照明要求4.4樣品制備純合體雜草稻檢測(cè)取樣按GB5491-1985執(zhí)行。上述純合體雜草稻檢測(cè)5.1純合體雜草稻檢測(cè)5.2雜合體雜草稻檢測(cè)3純合體雜草稻含量（M）以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）表示，m1-------糙米中紅色糙米的粒數(shù)，單位雜合體雜草稻含量（N）以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）表示，n1-------雜合條帶的膠孔數(shù)，單位為個(gè)。雜草稻總混雜率（T）以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）表示，按T=M+N………4RED4-Rev:TCTTCTCCTCTRED4-Rev:TCTTCTCCTCTCA.2PCR檢測(cè)A.2.1.1試樣PCR反應(yīng)個(gè)循環(huán);72℃延伸8min。反應(yīng)結(jié)束后取出PCR反應(yīng)管，對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)Primerforward(10μmoPrimerreverse(10μmo15A.2.1.2對(duì)照PCR反應(yīng)A.2.2.16%聚丙烯酰胺凝膠的制作a)制作底座：在桌面上鋪上報(bào)紙，用于擺放制膠用長(zhǎng)短板，在長(zhǎng)短板左右分別夾上兩片1mm厚薄凝膠溶液，在微波爐中加熱，沸騰2-3次至溶液澄清后倒入底使瓊脂糖進(jìn)入長(zhǎng)短板之間，室溫冷卻后，即可把板子下端封b)6%聚丙烯酰胺凝膠配制：5×TBE5ml,40%丙烯酰胺3.75ml，去離子水16.25ml，混勻后加入250ul10%過(guò)硫酸銨和12ulTEMED。攪拌后迅速進(jìn)行灌膠。加入少許混合液將縫隙完全灌滿。注意灌膠過(guò)程中不可氣泡，可以通過(guò)震蕩板子將氣泡趕出。d)聚丙烯酰胺凝膠的凝固：室溫下，聚丙烯酰胺凝膠經(jīng)過(guò)15-20分鐘將完全凝固，在此期間可以根Marker，用于判斷產(chǎn)物的長(zhǎng)度。電泳時(shí)電壓設(shè)置洗之后，輕輕撬開制膠板，將凝膠從板上剝離下來(lái)。再用去離子水清洗兩遍，瀝干；配AgNO3溶液，倒入盛有凝膠的盆中，將盆放在搖床上，蓋上蓋子避光漂染，轉(zhuǎn)速之后瀝干AgNO3溶液，并在去離子水中洗滌兩次；將400mLNaOH溶液倒入盛有凝膠的盆中，在搖床），用玻璃板撈出，平展整齊，在室溫下風(fēng)干至無(wú)水流出，然