DB21Thetechnicalspecificationsforremovingeuropeangenotypeporcinandrespiratorysyndromeinbreedingpigfarm遼寧省市場監(jiān)督管理局發(fā)布I 1 1 1 1 1 1 1 1 2 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 6娜、夏偉、邵奎龍、路暢、李紅偉、郭雪峰、孫洪廣、1種豬場歐洲型豬藍(lán)耳病凈化技術(shù)規(guī)范鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒高致病性與經(jīng)典毒株歐洲型豬藍(lán)耳?。‥uropeanGenotypePorcineReproductiveandRespiratorySyndrome；EU-PRRS）：由歐洲型豬繁殖與呼吸綜合）：4凈化群的建立4.1采樣數(shù)量和采樣時間4.1.1假定健康豬群24.1.2可疑感染豬群種公豬、種母豬分別按100%比例采血，或同時按104.1.3感染豬群種公豬、種母豬、后備豬分別按100%比例采血，或同時按100%比例采集精液，連續(xù)采集2次，間隔4.2檢測方法4.2.1檢測試劑和儀器本技術(shù)規(guī)范中使用的試劑，除另有說明外，所用試劑均為分析純；所有試劑均用無RNA酶的容器分本技術(shù)規(guī)范中需應(yīng)用下列試劑和材料：Trizol（RNA抽提試劑，外觀為粉紅色，分裝至棕色瓶中，于4℃~8℃保存）、氯仿（4℃預(yù)冷）、異丙醇（4℃預(yù)冷）、75%乙醇（用新開啟的無水乙醇和DEPC水配制20℃預(yù)冷）、DEPC水（1000mL雙蒸水中加入1mLDEPC，室溫下持續(xù)攪拌過夜，121℃高壓滅菌25min）、RNA酶抑制劑（40U/μL）、TaqDNA聚合酶（5U/μL）、dNTP(2.5mmoU/μL）、三羥甲基氨基甲烷-乙酸電泳緩沖液（TAE）、溴化乙錠（EB）、DL2000DNAMarker、上游引物：5,-,TAACCGAGCATACGCTGTGAGAAAG-3,，下游引物：5,-CAAATTAACTTGCACCCTGACTGGC-本技術(shù)規(guī)范中使用的設(shè)備包括：PCR擴(kuò)增儀，高速冷凍離心機(jī)（離心力在12000g以上），核酸電泳儀和水平電泳槽，組織均漿機(jī)或研缽，凝膠成像系統(tǒng)、微量4.2.2樣品的采集與處理4.2.2.1組織樣品：按照GB/T27517淋巴結(jié)、扁桃體、肺臟、脾臟、腎臟、胸腺等組于組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨，再加04.2.2.2血清或抗凝血：用無菌注射器自耳靜脈或前腔靜脈釆集血液3mL～5mL2mL～3mL，再自耳靜脈或前腔靜脈采集等量血液快速混勻后轉(zhuǎn)入無菌處理的樣品在2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過24h；若需長期保存，應(yīng)放置-70℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍4.2.2.4RNA提取及cDNA合成：按照Trizol提取試劑說明書提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)325μL4.2.2.6電泳：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物8μL與2μL上樣緩沖液混4.2.2.7結(jié)果判定）；4.3處理比例、母豬按25%比例采血或同時按相同比例采集活體豬扁桃體樣品，再次進(jìn)行歐洲型豬藍(lán)耳病病毒核酸檢測。歐洲型豬藍(lán)耳病病毒核酸檢測全部陰性，可視為假定歐洲型豬藍(lán)耳病陰性豬45.2后備豬的檢測豬藍(lán)耳病病毒保持陰性，樣品采集、檢測方法5.4病死豬的檢測法同4.2。如若檢出歐洲型豬藍(lán)耳病病毒核酸陽性，應(yīng)重新對種豬群種豬場應(yīng)符合下列所有條件，即達(dá)到歐洲型豬藍(lán)耳病凈化檢測陰性后方可啟運(yùn)引進(jìn)，引進(jìn)后隔離飼養(yǎng)45～607.2.1收集病死豬及母豬所生產(chǎn)的弱仔、死胎、流產(chǎn)胎兒，進(jìn)行歐洲型豬藍(lán)耳病病毒核酸檢5態(tài)下，要選用無刺激或刺激性小的消毒藥進(jìn)行舍內(nèi)環(huán)境病死豬及母豬所生產(chǎn)的死胎、流產(chǎn)胎兒按GB16548的要求，糞便按NY/T1168的要求進(jìn)行無害化處6A.2.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）A.2.2TAE(三羥甲基氨基甲烷－乙羥基甲基氨基甲烷（Tris分析純）0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液微波爐中完全融化，加溴化乙錠（EB）溶液20μL。7用磁力攪拌器室溫下持續(xù)攪拌過夜，分瓶包裝后121℃高壓A.6上樣緩沖液A.7電泳緩沖液（1倍）滅菌雙蒸水A.8磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L，pH7.4，PBS）氯化鈉（NaCl）氯化鉀（KCl）磷