DB21DB21/T2592.2—2016雞傳染性疾病檢測方法第2部分：雞傳染性支氣管炎病毒熒光RT-PCR診斷技術(shù)DetectionmethodofchickeninfectiousdiseasePart2：DiagnostictechniqueoffluorescentRT-PCRforavianinfectiousbronchitisvirus遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布 4 4 4 4 4 4 6 6 6 6 6 8 9本部分起草單位：遼寧省動物疫病預防控制中心、遼寧省動物本部分適用于禽類及其產(chǎn)品中雞傳染性支氣件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用DEPC：焦炭酸二乙酯（diethypyrocarbonatRNA：核糖核酸（ribonucleicadNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetRT-PCR：反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(reversetranscription-polymerasechainreactTaq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerasCt值：每個反應管內(nèi)的熒光信號量達到設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Cyclethresh4儀器與器材4.2高速臺式冷凍離心機（最大離心力124.8微量移液器（1000μL、5.1Trizol：RNA抽提試劑，外觀為粉紅色，分裝至棕色瓶中，于4℃~8℃保存。5.475%乙醇：用無水乙醇和DE5.13引物：用于RT-PCR反應引物濃度為10μmol/表1雞傳染性支氣管炎病毒熒光RT-PCR檢測用引物離心管（1.5mL、15mL）經(jīng)121℃±2℃高壓滅菌15min；醫(yī)用剪刀、鑷子、組織樣品研磨器經(jīng)樣品應置于特定樣品保存液中進行保存?？刹捎肞BS液（pH7.0～7.4,0.01mol/L）、0.85%生水或不含有血清的細胞培養(yǎng)液作為保存液（含青霉素2000IU/mL、鏈霉素2000IU/mL、制霉菌素1000IU/mL，BSA5mg/mL）。樣品采集后應置于加冰的保溫箱中-70℃保存。按照《獸醫(yī)實驗室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》進行樣品的生物安全若樣品為雞胚增殖病毒的尿囊液，可直接采用尿囊），每管加入750μLTrizol，分別加入被檢樣品、陽性對照和陰性對照各250離心15min。取與6.2.1中相同數(shù)量滅菌的1.5mL離心管，加入500μL異丙醇(4℃預冷)。取6.2.2清液約500μL轉(zhuǎn)移至相應的管中，顛倒混勻，室溫靜置15m4℃12000g離心15min加入20μL經(jīng)DEPC處理的水和2μLRNA酶抑制劑，輕柔混勻，溶解管壁上的RNA，冰上保存?zhèn)溆?。提取的RNA應在2h內(nèi)進行熒光RT-PCR擴增；于-70RNA酶抑制劑表3雞傳染性支氣管炎病毒熒光RT-PCR檢測PCR反應體系2)陽性對照的Ct值應≤28.0,并出3)如陰性對照和陽性條件不滿足以上條件2）陽性稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4?12H2O)71.64g，先加適量去離子水溶解，最后定容至10稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4?2H20)31.21g，先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，A.30.02mo