DB37豬附紅細(xì)胞體PCR檢測(cè)技術(shù)IDB37/T3086—2017本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陳蕾、杜以軍、齊靜、叢曉燕、孫文博、陳智、郭立輝、于江、吳家強(qiáng)、李俊、時(shí)建立。1DB37/T3086—2017豬附紅細(xì)胞體PCR檢測(cè)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室必須為生物安全Ⅱ級(jí)(BSL-2級(jí))及以上實(shí)驗(yàn)室。件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法SDS十二烷基硫酸鈉。5.1.1微量移液器(最大量程分別為10μL、20μL、100μL、1000μL),帶濾芯的槍頭。5.1.9燒杯(1000mL)。2DB37/T3086—20175.1.10電子天平精度為：0.001g。5.1.132℃~8℃冰箱。5.2試劑5.2.1蛋白酶K(見(jiàn)附錄A.1)。5.2.210%SDS液(見(jiàn)附錄A.2)。5.2.370%乙醇(見(jiàn)附錄A.3)。5.2.41.0%瓊脂糖凝膠(見(jiàn)附錄A.4)。5.2.6超純水：符合GB/T6682,三級(jí)。MS-Fwd:5-CGAGCGCAACCCTTCATAT-3;MS-Rev:5-CTACCATTGTAGCACGTTTGCA-3;6操作程序臨床上豬的血液(肝素抗凝血),置于2℃~8℃冰箱保存。6.1.2樣品的處理6.1.2.1取肝素抗凝血液約5ml。6.2DNA的提取6.2.1取肝素抗凝血500μL于1.5mL離心管中，加入50μg/mL的蛋白酶K5μL,加入10%的6.2.2加入200μLTris飽和酚，充分混勻，10000g離心15min。6.2.3取上清于一新的離心管中，加入200μLTris飽和酚和200μL氯仿，10000g離心15min。6.2.5取上清于一新離心管中，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，-20℃靜置20min,10000g離心15min,棄上清。6.2.6加入70%的乙醇沖洗沉淀表面及管壁，棄乙醇，晾干。6.2.7加入100μL滅菌雙蒸水溶解沉淀，-20℃保存?zhèn)溆?。試?yàn)中同時(shí)設(shè)立豬附紅細(xì)胞體DNA作為3DB37/T3086—2017表1PCR反應(yīng)體系(50μL)序號(hào)體系組成體系含量1滅菌雙蒸水2DNA310mmol/L上游引物410mmol/L下游引物510×PCRBuffer62.5mmol/LdNTPs7Taq酶瞬時(shí)離心，使液體都沉降到PCR管底。循環(huán)參數(shù)為95℃5min,94℃30s,52℃45s,72℃1min,循環(huán)30次，72℃延伸10min結(jié)束。6.4.1制備1.0%瓊脂糖凝膠板，見(jiàn)附錄A.4。7.1在陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)127bp擴(kuò)增帶、陰性對(duì)照無(wú)此擴(kuò)增帶時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立(參見(jiàn)附錄A.5)。胞體陰性(參見(jiàn)附錄A.6)。4DB37/T3086—2017A.1蛋白酶K溶液(20mg/mL)試劑名稱(chēng)用量蛋白酶K滅菌雙蒸水試劑名稱(chēng)